Trattamento delle malattie genetiche mediante virus. Tutto quello che devi sapere sulla terapia genica

Il mercato della terapia genica ha il potenziale per diventare il mercato in più rapida crescita a livello mondiale nei prossimi 10 anni. Le prospettive aperte dalla manipolazione genetica motivano i rappresentanti di Big Pharma non solo a condurre le proprie ricerche, ma anche ad acquisire attivamente le aziende più promettenti.

Il colosso farmaceutico Novartis, a quanto pare, può segnare l’inizio dell’introduzione su vasta scala della terapia genica nella pratica clinica globale: la Food and Drug Administration (FDA) ha approvato l’uso della terapia genica per pazienti di età compresa tra 3 e 25 anni affetti da leucemia linfoblastica acuta.

Il trattamento aiuta a ottenere la remissione e in alcuni casi addirittura a sconfiggere la malattia. I media hanno giustamente soprannominato questo evento la "nuova era della medicina": l'umanità, con l'aiuto della manipolazione genetica, sta gradualmente affrontando malattie precedentemente incurabili.

Diamo uno sguardo indietro a ciò che ha portato all'inizio della "nuova era" e vediamo dove si sta dirigendo uno dei mercati più promettenti.

Come tutto cominciò

Circa 15 anni fa, gli scienziati sono riusciti a “leggere” il genoma e finalmente ad avere accesso al “codice sorgente” del corpo umano, che memorizza tutti i dati necessari su di esso e, soprattutto, ne controlla la vita e la morte. Ci sono voluti molti altri anni per comprendere le conoscenze acquisite e iniziare gradualmente a tradurle nel campo dell'applicazione pratica: prima nella diagnostica e poi nella pratica clinica.

Negli ultimi 100 anni, la scienza è diventata abbastanza brava ad affrontare gli agenti causali di varie malattie, come virus e batteri - grazie a vaccini e antibiotici - ma le malattie causate da mutazioni nei geni sono state a lungo considerate incurabili. Pertanto, la decifrazione di oltre 3 miliardi di coppie di nucleotidi ha aperto prospettive davvero illimitate per lo sviluppo della "medicina del futuro": principalmente la terapia genetica preventiva e, idealmente, una medicina completamente personalizzata.

Gli esperti di mercato prevedono una rapida crescita in queste aree: si prevede che il mercato della terapia genica per il cancro raggiungerà i 4 miliardi di dollari entro il 2024, il mercato della terapia genica nel suo complesso dovrebbe raggiungere gli 11 miliardi di dollari entro il 2025 e le previsioni per tutta la medicina personalizzata sono ancora più ottimistiche: da 149 miliardi di dollari nel 2020 a 2,5 trilioni di dollari entro il 2022.

I primi frutti della decifrazione del genoma umano furono il miglioramento della diagnosi delle malattie congenite o della predisposizione ad esse (molti ricorderanno il caso del gene BRCA1 e di Angelina Jolie). In questo contesto, ha cominciato a svilupparsi rapidamente il mercato della cosiddetta “genetica di consumo”, che entro il 2020 raggiungerà i 12 miliardi di dollari.

I test genetici danno al paziente l'opportunità di condurre un'analisi e trovare “geni cattivi” nel suo corpo o, al contrario, rallegrarsi della loro assenza. Inizialmente piuttosto costoso ($ 999-2500), è diventato sempre più conveniente man mano che il costo del sequenziamento è diminuito. Ad esempio, il prezzo di uno studio completo, offerto oggi da 23andMe, uno dei leader del mercato mondiale, è di 199 dollari. In Russia i prezzi sono leggermente più alti: da 20.000 a 30.000 rubli.

Inoltre, la terapia mirata sta diventando una realtà, il che è particolarmente importante non solo per le malattie ereditarie, ma anche per le malattie cardiovascolari e infettive, nonché per l'oncologia, le principali cause di morte in tutto il mondo. La manipolazione genetica consente di introdurre geni “buoni” in un paziente per compensare i problemi causati dal cattivo funzionamento dei geni “cattivi” - ad esempio, come nel caso dell'emofilia, e in futuro potranno anche "riparare" o rimuovere completamente i geni dannosi, ad esempio quelli che causano la malattia neurodegenerativa di Huntington. Sebbene la terapia genica occupi un posto molto modesto nel mercato farmaceutico, la sua quota è destinata a crescere costantemente.

Naturalmente, ci sono ancora molti problemi da risolvere: questi sono l’alto rischio di reazioni immunitarie, l’alto costo della terapia e, forse, anche le questioni etiche legate alla realizzazione di cambiamenti nel corpo umano a livello genetico. Tuttavia, tali manipolazioni rappresentano un’opportunità per i pazienti le cui malattie sono considerate incurabili o non possono essere trattate efficacemente con i farmaci esistenti, nonché una nuova arma nella lotta contro l’invecchiamento, dando all’umanità la speranza di una sana longevità a un livello completamente diverso, e la possibilità mercato: quelli nuovi in cui sono presenti percorsi di sviluppo più promettenti.

Prime vittorie

Questo programma inizia ad operare dal momento della pubertà e porta lentamente ma inesorabilmente alla morte. Inoltre, questo è un processo abbastanza regolamentato. Ogni specie ha un chiaro limite di vita che le viene assegnato. In un topo, ad esempio, sono in media 2,5 anni, in una persona sono circa 80 anni. Allo stesso tempo, ci sono altri roditori che vivono più volte o addirittura un ordine di grandezza più a lungo dei topi, ad esempio gli scoiattoli o la famosa talpa nuda.

La domanda principale è se l’invecchiamento possa essere disattivato o almeno rallentato. Forse una tecnologia rivoluzionaria che inverte lo sviluppo cellulare, scoperta da Shinya Yamanaka, professore presso l'Istituto di scienze mediche avanzate dell'Università di Kyoto, aiuterà a rispondere a questa domanda: ha scoperto che inducendo la coespressione di quattro fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc, e tutti insieme - OSKM, o fattori Yamanaka), che sono strettamente correlati alle fasi principali del ciclo di vita cellulare, trasformano le cellule somatiche in cellule pluripotenti. Per questa scoperta davvero rivoluzionaria, Yamanaka ha ricevuto il Premio Nobel nel 2012.

Utilizzando la scoperta di Yamanaka, un team di scienziati del Salk Institute guidato da Juan Carlos Izpisua Belmonte ha cercato di utilizzare questo meccanismo naturale di ripristino dell'orologio biologico per prolungare la vita degli animali adulti. E non mi sbagliavo. Usando i fattori Yamanaka, sono stati in grado di confermare l’ipotesi sulla possibilità di riportare indietro l’“orologio epigenetico”, cioè il ringiovanimento cellulare, e di aumentare l’aspettativa di vita media dei topi che invecchiano rapidamente del 33%-50% rispetto a vari gruppi di controllo .

La distrofia muscolare di Duchenne è una delle malattie genetiche rare, ma ancora relativamente comuni. La malattia viene diagnosticata all'età di tre-cinque anni, di solito nei ragazzi, inizialmente si manifesta solo con movimenti difficili, all'età di dieci anni una persona affetta da tale distrofia muscolare non può più camminare, e all'età di 20 anni; 22 la sua vita finisce. È causata da una mutazione nel gene della distrofina, che si trova sul cromosoma X. Codifica per una proteina che collega la membrana cellulare muscolare alle fibre contrattili. Funzionalmente, è una sorta di molla che garantisce una contrazione regolare e l'integrità della membrana cellulare. Le mutazioni nel gene portano alla distrofia del tessuto muscolare scheletrico, del diaframma e del cuore. Il trattamento della malattia è palliativo e può alleviare solo leggermente la sofferenza. Tuttavia, con lo sviluppo dell’ingegneria genetica, si vede la luce alla fine del tunnel.

A proposito di guerra e pace

La terapia genica è la somministrazione di costrutti a base di acido nucleico nelle cellule per trattare le malattie genetiche. Con l'aiuto di tale terapia è possibile correggere un problema genetico a livello di DNA e RNA, modificando il processo di espressione della proteina desiderata. Ad esempio, il DNA con una sequenza corretta può essere consegnato in una cellula, con la quale viene sintetizzata una proteina funzionale. Oppure, al contrario, è possibile rimuovere alcune sequenze genetiche, il che aiuterà anche a ridurre gli effetti dannosi della mutazione. In teoria questo è semplice, ma in pratica la terapia genica si basa sulle tecnologie più complesse per lavorare con oggetti microscopici e rappresenta un insieme di know-how avanzato nel campo della biologia molecolare.

L'iniezione di DNA nel pronucleo dello zigote è una delle prime e più tradizionali tecnologie per la creazione di transgeni. L'iniezione viene eseguita manualmente utilizzando aghi ultrasottili al microscopio con ingrandimento 400x.

"Il gene della distrofina, le cui mutazioni danno origine alla distrofia muscolare di Duchenne, è enorme", afferma Vadim Zhernovkov, direttore dello sviluppo della società di biotecnologia Marlin Biotech, candidato alle scienze biologiche. “Include 2,5 milioni di coppie di nucleotidi, che potrebbero essere paragonate al numero di lettere nel romanzo Guerra e pace”. E immaginiamo di aver strappato alcune pagine importanti dell’epopea. Se queste pagine descrivessero eventi significativi, allora già comprendere il libro sarebbe difficile. Ma con il gene tutto è più complicato. Non sarebbe difficile trovare un'altra copia di Guerra e pace, e poi si potrebbero leggere le pagine mancanti. Ma il gene della distrofina si trova sul cromosoma X e negli uomini ce n'è solo uno. Pertanto, alla nascita, nei cromosomi sessuali dei maschi è conservata solo una copia del gene. Non c'è nessun posto dove trovarne un altro.

Infine, quando le proteine vengono sintetizzate dall'RNA, è importante preservare la cornice di lettura. La cornice di lettura determina quale gruppo di tre nucleotidi viene letto come un codone, corrispondente a un amminoacido in una proteina. Se in un gene viene cancellato un frammento di DNA che non è multiplo di tre nucleotidi, la cornice di lettura cambia: la codifica cambia. Ciò potrebbe essere paragonato alla situazione in cui, dopo aver strappato le pagine dell'intero libro rimanente, tutte le lettere vengono sostituite con quelle successive dell'alfabeto. Il risultato sarà abracadabra. La stessa cosa accade con le proteine sintetizzate in modo improprio”.

Cerotto biomolecolare

Uno dei metodi efficaci della terapia genica per ripristinare la normale sintesi proteica è lo skipping dell'esone utilizzando brevi sequenze nucleotidiche. Marlin Biotech ha già sviluppato la tecnologia per lavorare con il gene della distrofina utilizzando questo metodo. Come è noto, nel processo di trascrizione (sintesi dell'RNA), si forma prima il cosiddetto RNA pre-template, che contiene sia regioni codificanti proteine (esoni) che regioni non codificanti (introni). Successivamente inizia il processo di splicing, durante il quale gli introni e gli esoni vengono separati e si forma un RNA “maturo”, costituito solo da esoni. In questo momento alcuni esoni possono essere bloccati, “sigillati” con l'aiuto di molecole speciali. Di conseguenza, l'RNA maturo non conterrà quelle regioni codificanti di cui preferiremmo eliminare, e quindi la cornice di lettura verrà ripristinata e la proteina verrà sintetizzata.

"Abbiamo messo a punto questa tecnologia in vitro", afferma Vadim Zhernovkov, cioè su colture cellulari coltivate da cellule di pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne. Ma le singole cellule non sono un organismo. Invadendo i processi cellulari, dobbiamo osservarne le conseguenze dal vivo, ma non è possibile coinvolgere le persone nelle sperimentazioni per vari motivi, da quelli etici a quelli organizzativi. Pertanto, era necessario ottenere un modello animale da laboratorio della distrofia muscolare di Duchenne con determinate mutazioni”.

Come iniettare un microcosmo

Gli animali transgenici sono animali ottenuti in laboratorio in cui sono state apportate intenzionalmente e deliberatamente modifiche al loro genoma. Negli anni '70 del secolo scorso divenne chiaro che la creazione di transgeni è il metodo più importante per studiare le funzioni di geni e proteine. Uno dei primi metodi per ottenere un organismo completamente geneticamente modificato è stata l'iniezione di DNA nel pronucleo ("precursore del nucleo") degli zigoti delle uova fecondate. Ciò è logico, poiché è più facile modificare il genoma di un animale all’inizio del suo sviluppo.

Il diagramma mostra il processo CRISPR/Cas9, che coinvolge un RNA subgenomico (sgRNA), una sua regione che funge da RNA guida e una proteina nucleasi Cas9 che taglia entrambi i filamenti del DNA genomico nella posizione specificata dall'RNA guida.

L'iniezione nel nucleo di uno zigote è una procedura molto non banale, perché stiamo parlando di microscala. L'uovo del topo ha un diametro di 100 micron e il pronucleo è di 20 micron. L'operazione avviene al microscopio con ingrandimento 400x, ma l'iniezione è il lavoro più manuale. Naturalmente, per l'“iniezione” non viene utilizzata una siringa tradizionale, ma uno speciale ago di vetro con un canale cavo all'interno, nel quale viene raccolto il materiale genetico. Un'estremità può essere tenuta in mano e l'altra, ultrasottile e affilata, è praticamente invisibile ad occhio nudo. Naturalmente, una struttura così fragile in vetro borosilicato non può essere conservata a lungo, quindi il laboratorio ha a disposizione una serie di grezzi, che vengono estratti su una macchina speciale immediatamente prima del lavoro. Viene utilizzato uno speciale sistema di visualizzazione con contrasto della cellula senza colorazione: l'intervento nel pronucleo è di per sé traumatico ed è un fattore di rischio per la sopravvivenza della cellula. La vernice sarebbe un altro fattore simile. Fortunatamente, le uova sono abbastanza resistenti, ma il numero di zigoti che danno origine ad animali transgenici rappresenta solo una piccola percentuale del numero totale di uova in cui è stato iniettato il DNA.

La fase successiva è chirurgica. È in corso un'operazione per trapiantare zigoti microiniettati nell'ovidotto del topo ricevente, che diventerà una madre surrogata per i futuri transgeni. Successivamente, l'animale da laboratorio attraversa naturalmente un ciclo di gravidanza e nasce la prole. Tipicamente, una lettiera contiene circa il 20% di topi transgenici, il che indica anche l'imperfezione del metodo, poiché contiene un ampio elemento di casualità. Una volta iniettati, il ricercatore non può controllare esattamente come i frammenti di DNA introdotti verranno integrati nel genoma del futuro organismo. Esiste un'alta probabilità di tali combinazioni che porteranno alla morte dell'animale nella fase embrionale. Tuttavia, il metodo funziona ed è abbastanza adatto per una serie di scopi scientifici.

Lo sviluppo di tecnologie transgeniche rende possibile la produzione di proteine animali richieste dall'industria farmaceutica. Queste proteine vengono estratte dal latte di capre e mucche transgeniche. Esistono anche tecnologie per ottenere proteine specifiche dalle uova di gallina.

Forbici per DNA

Ma esiste un modo più efficace basato sull’editing mirato del genoma utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9. "Oggi la biologia molecolare è in qualche modo simile all'era delle spedizioni marittime a lunga distanza a vela", afferma Vadim Zhernovkov. — Quasi ogni anno in questa scienza si verificano scoperte significative che possono cambiare le nostre vite. Ad esempio, diversi anni fa i microbiologi scoprirono l’immunità alle infezioni virali in una specie di batteri apparentemente studiata da molto tempo. Come risultato di ulteriori ricerche, si è scoperto che il DNA batterico contiene loci speciali (CRISPR), da cui vengono sintetizzati frammenti di RNA che possono legarsi in modo complementare agli acidi nucleici di elementi estranei, ad esempio virus DNA o RNA. La proteina Cas9, che è un enzima nucleasi, si lega a tale RNA. L'RNA funge da guida per Cas9, contrassegnando una sezione specifica del DNA in cui la nucleasi effettua un taglio. Circa tre o cinque anni fa sono apparsi i primi articoli scientifici in cui veniva sviluppata la tecnologia CRISPR/Cas9 per l’editing del genoma”.

I topi transgenici consentono la creazione di modelli viventi di gravi malattie genetiche umane. Le persone dovrebbero essere grate a queste piccole creature.

Rispetto al metodo che prevede l'introduzione di un costrutto per l'inserimento casuale, il nuovo metodo consente di selezionare elementi del sistema CRISPR/Cas9 in modo tale da indirizzare con precisione le guide RNA alle regioni desiderate del genoma e ottenere l'eliminazione o l'inserimento mirato di la sequenza di DNA desiderata. Anche questo metodo è soggetto a errori (l'RNA guida a volte si lega al sito sbagliato dove viene preso di mira), ma quando si utilizza CRISPR/Cas9, l'efficienza nella creazione di transgeni è già di circa l'80%. "Questo metodo ha ampie prospettive, non solo per la creazione di transgeni, ma anche in altri settori, in particolare nella terapia genica", afferma Vadim Zhernovkov. “Tuttavia, la tecnologia è solo all’inizio del suo viaggio ed è abbastanza difficile immaginare che nel prossimo futuro il codice genetico delle persone verrà corretto utilizzando CRISPR/Cas9. Sebbene esista la possibilità di errore, esiste anche il pericolo che una persona perda alcune importanti parti codificanti del genoma”.

Medicina del latte

L'azienda russa Marlin Biotech è riuscita a creare un topo transgenico in cui è riprodotta completamente la mutazione che porta alla distrofia muscolare di Duchenne, e la fase successiva sarà quella di testare le tecnologie di terapia genica. Tuttavia, la creazione di modelli di malattie genetiche umane basati su animali da laboratorio non è l’unico utilizzo possibile dei transgeni. Pertanto, in Russia e nei laboratori occidentali, si lavora nel campo della biotecnologia, consentendo di ottenere proteine medicinali di origine animale importanti per l'industria farmaceutica. Mucche o capre possono fungere da produttori, in cui è possibile modificare l'apparato cellulare per la produzione delle proteine contenute nel latte. È possibile estrarre proteine medicinali dal latte, che si ottiene non con un metodo chimico, ma con un meccanismo naturale, che aumenterà l'efficacia del medicinale. Attualmente sono state sviluppate tecnologie per la produzione di proteine medicinali come lattoferrina umana, prourochinasi, lisozima, atrina, antitrombina e altre.

introduzione

Ogni anno nelle riviste scientifiche compaiono sempre più articoli su studi clinici medici in cui, in un modo o nell'altro, è stato utilizzato un trattamento basato sull'introduzione di vari geni: la terapia genica. Questa direzione è nata da rami della biologia ben sviluppati come la genetica molecolare e la biotecnologia.

Spesso, quando i metodi convenzionali (conservatori) sono già stati provati, è la terapia genica che può aiutare i pazienti a sopravvivere e persino a riprendersi completamente. Questo vale, ad esempio, per le malattie ereditarie monogeniche, cioè quelle causate da un difetto in un singolo gene, così come per molte altre. Oppure, ad esempio, la terapia genica può aiutare e salvare l'arto di quei pazienti che hanno ristretto il lume dei vasi sanguigni negli arti inferiori e, di conseguenza, si è sviluppata un'ischemia persistente dei tessuti circostanti, cioè questi tessuti sperimentano una grave mancanza di nutrienti e ossigeno, che normalmente vengono trasportati dal sangue in tutto il corpo. Spesso è impossibile trattare questi pazienti con manipolazioni chirurgiche e farmaci, ma se le cellule fossero costrette localmente a rilasciare più fattori proteici che influenzerebbero il processo di formazione e germinazione di nuovi vasi, l'ischemia diventerebbe molto meno pronunciata e la vita diventerebbe più molto più facile per i pazienti.

Terapia genetica oggi può essere definito come il trattamento delle malattie introducendo geni nelle cellule dei pazienti per modificare specificamente i difetti genetici o conferire alle cellule nuove funzioni. I primi studi clinici sui metodi di terapia genica sono stati intrapresi di recente, il 22 maggio 1989, allo scopo di diagnosticare il cancro. La prima malattia ereditaria per la quale sono stati applicati metodi di terapia genica è stata l’immunodeficienza ereditaria.

Ogni anno cresce il numero di studi clinici condotti con successo per il trattamento di varie malattie mediante la terapia genica e nel gennaio 2014 ha raggiunto i 2mila.

Allo stesso tempo, nella ricerca moderna sulla terapia genica è necessario tenere conto del fatto che le conseguenze della manipolazione dei geni o del DNA “mischiato” (ricombinante) in vivo(dal latino letteralmente “nei vivi”) non sono stati sufficientemente studiati. Nei paesi con il livello più avanzato di ricerca in questo settore, soprattutto negli Stati Uniti, i protocolli medici che utilizzano sequenze di DNA sensoriale sono soggetti a revisione obbligatoria da parte dei comitati e delle commissioni competenti. Negli USA si tratta del Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) e della Food and Drug Administration (FDA), con successiva approvazione obbligatoria del progetto da parte del direttore del National Institutes of Health.

Quindi, abbiamo deciso che questo trattamento si basa sul fatto che se alcuni tessuti del corpo sono carenti di alcuni fattori proteici individuali, allora questo può essere corretto introducendo i geni corrispondenti che codificano per le proteine in questi tessuti, e tutto diventerà più o meno meno meraviglioso. Non sarà possibile introdurre le proteine stesse, perché il nostro organismo reagirebbe immediatamente con una forte reazione immunitaria e la durata dell'azione sarebbe insufficiente. Ora devi decidere il metodo per fornire il gene alle cellule.

Trasfezione cellule

Innanzitutto, vale la pena introdurre le definizioni di alcuni termini.

Il trasporto genico viene effettuato grazie a vettoreè una molecola di DNA utilizzata come “veicolo” per il trasferimento artificiale di informazioni genetiche in una cellula. Esistono molti tipi di vettori: plasmidici, virali, ma anche cosmidi, fasmidi, cromosomi artificiali, ecc. È di fondamentale importanza che i vettori (in particolare quelli plasmidici) abbiano proprietà loro caratteristiche:

1. Origine della replicazione (ori)- la sequenza di nucleotidi da cui inizia la duplicazione del DNA. Se il DNA vettore non può raddoppiarsi (replicarsi), l'effetto terapeutico necessario non sarà raggiunto, perché verrà semplicemente scomposto rapidamente dagli enzimi nucleasi intracellulari e, a causa della mancanza di modelli, alla fine si formeranno molte meno molecole proteiche. Va notato che questi punti sono specifici per ogni specie biologica, cioè se si suppone che il DNA vettore si ottenga propagandolo in una coltura batterica (e non solo mediante sintesi chimica, che di solito è molto più costosa), allora due saranno necessarie origini di replicazione separate: per gli esseri umani e per i batteri;

2. Siti di restrizione- specifiche brevi sequenze (solitamente palindromiche), che vengono riconosciute da speciali enzimi (endonucleasi di restrizione) e da loro tagliate in un certo modo - con la formazione di "estremità appiccicose" (Fig. 1).

Fig.1 Formazione di “estremità appiccicose” con la partecipazione di enzimi di restrizione

Questi siti sono necessari per ricucire il DNA vettoriale (che, in sostanza, è un “grezzo”) con i geni terapeutici desiderati in un'unica molecola. Tale molecola reticolata da due o più parti è detta “ricombinante”;

3. È chiaro che vorremmo ottenere milioni di copie di una molecola di DNA ricombinante. Ancora una volta, se abbiamo a che fare con una coltura cellulare batterica, allora questo DNA deve essere isolato. Il problema è che non tutti i batteri ingeriscono la molecola di cui abbiamo bisogno; alcuni non lo fanno. Per distinguere questi due gruppi, inseriscono marcatori selettivi- aree di resistenza a determinati prodotti chimici; Ora, se aggiungi queste stesse sostanze all'ambiente, solo quelle resistenti sopravvivranno e il resto morirà.

Tutti questi tre componenti possono essere osservati nel primissimo plasmide sintetizzato artificialmente (Fig. 2).

Fig.2

Viene chiamato il processo di introduzione di un vettore plasmidico in determinate cellule trasfezione. Un plasmide è una molecola di DNA abbastanza corta e solitamente circolare che si trova nel citoplasma di una cellula batterica. I plasmidi non sono associati al cromosoma batterico, possono replicarsi indipendentemente da esso, possono essere rilasciati dal batterio nell'ambiente o, al contrario, assorbiti (il processo di assorbimento è trasformazione). Con l'aiuto dei plasmidi, i batteri possono scambiarsi informazioni genetiche, ad esempio trasmettendo resistenza a determinati antibiotici.

I plasmidi esistono naturalmente nei batteri. Ma nessuno può impedire a un ricercatore di sintetizzare artificialmente un plasmide che avrà le proprietà di cui ha bisogno, inserendovi un inserto genetico e introducendolo nella cellula. Nello stesso plasmide possono essere inseriti diversi inserti .

Metodi di terapia genica

Esistono due approcci principali, che differiscono nella natura delle cellule bersaglio:

1. Fetale, in cui il DNA estraneo viene introdotto nello zigote (uovo fecondato) o nell'embrione in una fase iniziale di sviluppo; in questo caso si prevede che il materiale introdotto penetri in tutte le cellule del ricevente (e anche nelle cellule germinali, garantendo così la trasmissione alla generazione successiva). Nel nostro Paese è addirittura vietato;

2. Somatico, in cui il materiale genetico viene introdotto nelle cellule non riproduttive di una persona già nata e non viene trasmesso alle cellule germinali.

Terapia genetica in vivo si basa sull'introduzione diretta di sequenze di DNA clonate (moltiplicate) e confezionate in un certo modo in determinati tessuti del paziente. Particolarmente promettente per il trattamento delle malattie genetiche in vivo è l'introduzione di geni mediante aerosol o vaccini iniettati. La terapia genica con aerosol è sviluppata, di norma, per il trattamento delle malattie polmonari (fibrosi cistica, cancro ai polmoni).

Ci sono molti passaggi coinvolti nello sviluppo di un programma di terapia genica. Ciò include un'analisi approfondita dell'espressione tessuto-specifica del gene corrispondente (cioè la sintesi sulla matrice di un gene di alcune proteine in un determinato tessuto), l'identificazione di un difetto biochimico primario e uno studio della struttura, della funzione e distribuzione intracellulare del suo prodotto proteico, nonché un'analisi biochimica del processo patologico. Tutti questi dati vengono presi in considerazione durante la stesura del protocollo medico appropriato.

È importante che quando si elaborano schemi di correzione genetica, vengano valutati l'efficienza della trasfezione e il grado di correzione del difetto biochimico primario in condizioni di coltura cellulare ( in vitro,"in vitro") e, soprattutto, in vivo su modelli biologici animali. Solo dopo potrà iniziare il programma di sperimentazione clinica .

Consegna diretta e portatori cellulari di geni terapeutici

Esistono molti metodi per introdurre DNA estraneo in una cellula eucariotica: alcuni dipendono dal trattamento fisico (elettroporazione, magnetofezione, ecc.), altri dall'uso di materiali chimici o particelle biologiche (ad esempio virus) che vengono utilizzati come trasportatori. Vale subito la pena ricordare che i metodi chimici e fisici sono solitamente combinati (ad esempio, elettroporazione + avvolgimento del DNA nei liposomi)

Metodi diretti

1. La trasfezione su base chimica può essere classificata in diversi tipi: utilizzando una sostanza ciclodestrina, polimeri, liposomi o nanoparticelle (con o senza funzionalizzazione chimica o virale, cioè modificazione della superficie).
a) Uno dei metodi più economici è utilizzare il fosfato di calcio. Aumenta l’efficienza dell’incorporazione del DNA nelle cellule di 10-100 volte. Il DNA forma un forte complesso con il calcio, che ne garantisce l'assorbimento efficace. Svantaggio: solo circa l'1-10% del DNA raggiunge il nucleo. Metodo utilizzato in vitro per trasferire il DNA nelle cellule umane (Fig. 3);

Fig.3

b) L'uso di molecole organiche altamente ramificate - dendrimero, per legare il DNA e trasferirlo nella cellula (Fig. 4);

Fig.4

c) Un metodo molto efficace per la trasfezione del DNA è la sua introduzione attraverso i liposomi - piccoli corpi circondati da membrana che possono fondersi con la membrana citoplasmatica cellulare (CPM), che è un doppio strato di lipidi. Per le cellule eucariotiche, la trasfezione è più efficiente utilizzando liposomi cationici perché le cellule sono più sensibili ad essi. Il processo ha il suo nome: lipofezione. Questo metodo è considerato uno dei più sicuri oggi. I liposomi sono non tossici e non immunogenici. Tuttavia, l’efficienza del trasferimento genico mediante liposomi è limitata, poiché il DNA che essi introducono nelle cellule viene solitamente immediatamente catturato dai lisosomi e distrutto. L'introduzione del DNA nelle cellule umane utilizzando i liposomi è oggi il pilastro della terapia. in vivo(figura 5);

Fig.5

d) Un altro metodo è l'uso di polimeri cationici come il dietilamminoetil destrano o la polietilenimmina. Le molecole di DNA caricate negativamente si legano a policationi caricati positivamente e questo complesso entra quindi nella cellula per endocitosi. Il DEAE-destrano modifica le proprietà fisiche della membrana plasmatica e stimola l'assorbimento di questo complesso nella cellula. Lo svantaggio principale del metodo è che il DEAE-destrano è tossico in alte concentrazioni. Il metodo non si è diffuso nella terapia genica;

e) Con l'aiuto di istoni e altre proteine nucleari. Queste proteine, contenenti molti amminoacidi caricati positivamente (Lys, Arg), in condizioni naturali aiutano a compattare una lunga catena di DNA in un nucleo cellulare relativamente piccolo.

2. Metodi fisici:

a) L'elettroporazione è un metodo molto diffuso; Un immediato aumento della permeabilità della membrana si ottiene sottoponendo le cellule a brevi esposizioni ad un intenso campo elettrico. È stato dimostrato che in condizioni ottimali il numero di trasformanti può raggiungere l'80% delle cellule sopravvissute. Attualmente non è utilizzato negli esseri umani (Fig. 6).

Fig.6

b) Il “Cell squeezing” è un metodo inventato nel 2013. Permette di trasportare molecole nelle cellule “comprimendo delicatamente” la membrana cellulare. Il metodo elimina la possibilità di tossicità o di targeting errato poiché non si basa su materiali esterni o campi elettrici;

c) La sonoporazione è un metodo per trasferire artificialmente il DNA estraneo nelle cellule esponendole agli ultrasuoni, provocando l'apertura dei pori nella membrana cellulare;
d) Trasfezione ottica - un metodo in cui viene praticato un minuscolo foro nella membrana (circa 1 μm di diametro) utilizzando un laser altamente focalizzato;
e) Trasfezione idrodinamica - un metodo per fornire costrutti genetici, proteine, ecc. da un aumento controllato della pressione nei capillari e nel fluido intercellulare, che provoca un aumento a breve termine della permeabilità delle membrane cellulari e la formazione di pori temporanei in esse. Viene effettuato mediante iniezione rapida nel tessuto e il rilascio non è specifico. Efficienza di consegna per il muscolo scheletrico - dal 22 al 60% ;

f) Microiniezione di DNA - introduzione nel nucleo di una cellula animale utilizzando sottili microtubuli di vetro (d=0,1-0,5 µm). Lo svantaggio è la complessità del metodo, esiste un'alta probabilità di distruzione del nucleo o del DNA; è possibile trasformare un numero limitato di celle. Non per uso umano.

3. Metodi basati su particelle.

a) Un approccio diretto alla trasfezione è una pistola genetica, in cui il DNA viene concatenato in una nanoparticella con solidi inerti (solitamente oro, tungsteno), che viene poi “sparato” diretto nei nuclei delle cellule bersaglio. Questo metodo viene applicato in vitro E in vivo per introdurre geni, in particolare, nelle cellule del tessuto muscolare, ad esempio, in una malattia come la distrofia muscolare di Duchenne. La dimensione delle particelle d'oro è 1-3 micron (Fig. 7).

Fig.7

b) La magnetofezione è un metodo che utilizza le forze del magnetismo per fornire il DNA alle cellule bersaglio. Innanzitutto, gli acidi nucleici (NA) vengono associati a nanoparticelle magnetiche e quindi, sotto l'influenza di un campo magnetico, le particelle vengono spinte nella cellula. L'efficacia è quasi del 100%, si nota evidente non tossicità. Entro 10-15 minuti, le particelle vengono registrate nella cella: questo è molto più veloce rispetto ad altri metodi.
c) Impalamento; "impalamento", lett. "impalamento" + "infezione") - un metodo di consegna che utilizza nanomateriali come nanotubi di carbonio e nanofibre. In questo caso le cellule vengono letteralmente forate da uno strato di nanofibrille. Il prefisso “nano” viene utilizzato per denotare le loro dimensioni molto piccole (entro i miliardesimi di metro) (Fig. 8).

Fig.8

Separatamente, vale la pena evidenziare un metodo come la trasfezione dell'RNA: non è il DNA che viene consegnato nella cellula, ma le molecole di RNA - i loro "successori" nella catena di biosintesi delle proteine; in questo caso vengono attivate speciali proteine che tagliano l'RNA in brevi frammenti - i cosiddetti. piccolo RNA interferente (siRNA). Questi frammenti si legano ad altre proteine e, in definitiva, ciò porta all'inibizione dell'espressione cellulare dei geni corrispondenti. In questo modo è possibile bloccare l’azione di quei geni nella cellula che potenzialmente al momento fanno più male che bene. La trasfezione dell'RNA ha trovato ampia applicazione, in particolare, in oncologia.

Vengono esaminati i principi di base della consegna genica utilizzando vettori plasmidici. Ora possiamo passare a considerare i metodi virali. I virus sono forme di vita non cellulari, il più delle volte costituiti da una molecola di acido nucleico (DNA o RNA) avvolta in un guscio proteico. Se eliminiamo dal materiale genetico del virus tutte quelle sequenze che causano malattie, allora anche l'intero virus può essere trasformato con successo in un "veicolo" per il nostro gene.

Viene chiamato il processo di introduzione del DNA in una cellula, mediato da un virus trasduzione.
In pratica, i più comunemente utilizzati sono i retrovirus, gli adenovirus e i virus adeno-associati (AAV). Innanzitutto, vale la pena capire quale dovrebbe essere il candidato ideale per la trasduzione tra i virus. I criteri sono che deve essere:

Stabile;
. capiente, cioè in grado di ospitare una quantità sufficiente di DNA;
. inerte rispetto alle vie metaboliche della cellula;
. preciso - idealmente, dovrebbe integrare il suo genoma in un locus specifico del genoma del nucleo ospite, ecc.

Nella vita reale è molto difficile combinare almeno diversi punti, quindi di solito la scelta viene fatta considerando ogni singolo caso separatamente (Fig. 9).

Fig.9

Dei tre virus più utilizzati elencati, il più sicuro e allo stesso tempo il più accurato è AAV. Quasi il loro unico inconveniente è la loro capacità relativamente piccola (circa 4800 bp), che, tuttavia, risulta essere sufficiente per molti geni .

Oltre ai metodi elencati, la terapia genica viene spesso utilizzata in combinazione con la terapia cellulare: in primo luogo, una coltura di alcune cellule umane viene piantata in un mezzo nutritivo, dopo di che i geni necessari vengono introdotti nelle cellule in un modo o nell'altro, coltivati per qualche tempo e ancora trapiantati nel corpo dell'ospite. Di conseguenza, le cellule possono essere riportate alle loro proprietà normali. Quindi, ad esempio, i globuli bianchi umani (leucociti) sono stati modificati per la leucemia (Fig. 10).

Fig.10

Il destino del gene dopo che è entrato nella cellula

Poiché tutto è più o meno chiaro con i vettori virali a causa della loro capacità di fornire in modo più efficiente i geni all'obiettivo finale: il nucleo, ci soffermeremo sul destino del vettore plasmidico.

A questo punto abbiamo ottenuto che il DNA ha superato la prima grande barriera: la membrana citoplasmatica della cellula.

Successivamente, in combinazione con altre sostanze, avvolte o meno, deve raggiungere il nucleo della cellula affinché uno speciale enzima - l'RNA polimerasi - sintetizzi una molecola di RNA messaggero (mRNA) su una matrice di DNA (questo processo è chiamato trascrizione). Solo dopo questo l'mRNA verrà rilasciato nel citoplasma, formerà un complesso con i ribosomi e, secondo il codice genetico, verrà sintetizzato un polipeptide, ad esempio il fattore di crescita vascolare (VEGF), che inizierà a svolgere una certa funzione terapeutica ( in questo caso si avvierà il processo di formazione di ramificazioni vascolari nei tessuti soggetti ad ischemia).

Per quanto riguarda l'espressione dei geni introdotti nel tipo cellulare richiesto, questo problema viene risolto con l'aiuto di elementi regolatori della trascrizione. Il tessuto in cui avviene l'espressione è spesso determinato dalla combinazione di un potenziatore tessuto-specifico (sequenza “potenziante”) con un promotore specifico (una sequenza di nucleotidi da cui l'RNA polimerasi inizia la sintesi), che può essere inducibile . È noto che l'attività genetica può essere modulata in vivo segnali esterni e poiché gli potenziatori possono funzionare con qualsiasi gene, nei vettori possono essere introdotti degli isolanti che aiutano l'potenziatore a funzionare indipendentemente dalla sua posizione e possono agire come barriere funzionali tra i geni. Ciascun potenziatore contiene una serie di siti di legame per l'attivazione o la soppressione dei fattori proteici. I promotori possono essere utilizzati anche per regolare il livello di espressione genica. Ad esempio, ci sono metallotioneina o promotori sensibili alla temperatura; promotori controllati dagli ormoni.

L'espressione di un gene dipende dalla sua posizione nel genoma. Nella maggior parte dei casi, i metodi virali esistenti comportano solo l’inserimento casuale di un gene nel genoma. Per eliminare tale dipendenza, durante la costruzione dei vettori, il gene viene fornito con sequenze nucleotidiche note, che consentono al gene di esprimersi indipendentemente da dove è inserito nel genoma.

Il modo più semplice per regolare l'espressione del transgene è dotarlo di un promotore indicatore sensibile a un segnale fisiologico, come il rilascio di glucosio o l'ipossia. Tali sistemi di controllo "endogeni" possono essere utili in alcune situazioni, come il controllo glucosio-dipendente della produzione di insulina. I sistemi di controllo “esogeni” sono più affidabili e universali, quando l’espressione genica è controllata farmacologicamente mediante l’introduzione di una piccola molecola di farmaco. Attualmente sono noti 4 principali sistemi di controllo: regolati dalla tetraciclina (Tet), dallo steroide insetto, dall'ecdisone o dai suoi analoghi, dal farmaco antiprogestinico mayfpristone (RU486) e dai dimerizzatori chimici come la rapamicina e i suoi analoghi. Tutti includono l'attrazione farmaco-dipendente del dominio di attivazione della trascrizione al promotore principale che porta il gene desiderato, ma differiscono nei meccanismi di questa attrazione .

Conclusione

Un esame dei dati ci permette di giungere alla conclusione che, nonostante gli sforzi di numerosi laboratori in tutto il mondo, tutto ciò che è già noto e testato in vivo E in vitro i sistemi vettoriali sono tutt’altro che perfetti . Se c'è un problema con la consegna di DNA estraneo in vitro praticamente risolto e la sua consegna alle cellule bersaglio di diversi tessuti in vivo risolto con successo (principalmente creando costrutti che trasportano proteine recettoriali, compresi antigeni specifici per determinati tessuti), allora altre caratteristiche dei sistemi vettoriali esistenti - stabilità dell'integrazione, espressione regolata, sicurezza - richiedono ancora seri miglioramenti.

Si tratta innanzitutto della stabilità dell’integrazione. Finora l'integrazione nel genoma è stata ottenuta solo utilizzando vettori retrovirali o adeno-associati. L'efficienza dell'integrazione stabile può essere aumentata migliorando i costrutti genici come i sistemi mediati dai recettori o creando vettori episomali sufficientemente stabili (cioè strutture di DNA capaci di risiedere a lungo termine all'interno dei nuclei). Recentemente, particolare attenzione è stata prestata alla creazione di vettori basati su cromosomi artificiali di mammiferi. A causa della presenza degli elementi strutturali di base dei cromosomi ordinari, tali mini-cromosomi vengono trattenuti a lungo nelle cellule e sono in grado di trasportare geni (genomici) a grandezza naturale e i loro elementi regolatori naturali, necessari per il corretto funzionamento del gene, nel tessuto giusto e al momento giusto.

La terapia genica e cellulare apre brillanti prospettive per il ripristino di cellule e tessuti perduti e per la progettazione di organi con l'ingegneria genetica, che senza dubbio amplierà in modo significativo l'arsenale di metodi per la ricerca biomedica e creerà nuove opportunità per preservare ed estendere la vita umana.

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Stabilire la posizione e la sequenza del gene le cui mutazioni causano malattie specifiche, così come la mutazione stessa e i moderni metodi per testarla, rendono possibile la diagnosi della malattia nel periodo neo- e anche prenatale dello sviluppo del corpo. Ciò consente di mitigare la manifestazione di un difetto genetico con l'aiuto di farmaci, dieta, trasfusioni di sangue, ecc.

Tuttavia, questo approccio non porta alla correzione del difetto stesso e, di norma, le malattie ereditarie non vengono curate. La situazione è ulteriormente complicata dal fatto che una mutazione in un gene può avere effetti molto diversi sull’organismo. Se una mutazione genetica provoca cambiamenti nell'attività dell'enzima che codifica, ciò può portare all'accumulo di un substrato tossico o, al contrario, alla carenza di un composto necessario per il normale funzionamento della cellula.

Un noto esempio di tale malattia è la fenilchetonuria. È causata da una mutazione nel gene dell’enzima epatico fenilalanina deidrossilasi, che catalizza la conversione della fenilalanina in tirosina. Di conseguenza, il livello di fenilalanina endogena nel sangue aumenta, causando una formazione impropria della guaina mielinica attorno agli assoni delle cellule nervose del sistema nervoso centrale e, di conseguenza, un grave ritardo mentale.

Se una mutazione colpisce un gene di una proteina strutturale, può portare a gravi disturbi a livello di cellule, tessuti o organi. Un esempio di tale malattia è la fibrosi cistica.

Una delezione nel gene che codifica per una proteina chiamata trasportatore della fibrosi cistica provoca una sintesi proteica difettosa (mancanza di fenilalanina 508) e un trasporto alterato degli ioni cloruro attraverso le membrane cellulari. Uno degli effetti più dannosi di ciò è che il muco che riveste e protegge i polmoni diventa anormalmente denso. Ciò rende difficile l’accesso alle cellule polmonari e favorisce l’accumulo di microrganismi dannosi. Le cellule che rivestono le vie aeree dei polmoni muoiono e vengono sostituite da tessuto fibroso cicatrizzato (da cui il nome della malattia). Di conseguenza, il paziente muore per insufficienza respiratoria.

Le malattie ereditarie hanno manifestazioni cliniche complesse e il loro trattamento tradizionale è principalmente sintomatico: per trattare la fenilchetonuria viene prescritta una dieta priva di alanina, le proteine difettose vengono sostituite con somministrazione endovenosa funzionale e viene eseguito il trapianto di midollo osseo o di altri organi per compensare le funzioni perse. . Tutte queste misure sono generalmente inefficaci, costose, richiedono molto tempo e solo pochi pazienti vivono fino alla vecchiaia. Pertanto, lo sviluppo di tipi di terapia fondamentalmente nuovi è molto importante.

Terapia genetica

La terapia genica è l'ingegneria genetica delle cellule somatiche umane volta a correggere il difetto genetico che causa una malattia. La correzione di una malattia specifica viene effettuata introducendo geni normalmente espressi nelle cellule somatiche difettose. Negli anni '80, quando furono sviluppati metodi per ottenere singoli geni e furono creati vettori di espressione eucariotici, gli esperimenti di trasferimento genico nei topi divennero di routine e le prospettive di correzione genetica diventarono reali.

Nel 1990, negli Stati Uniti, il dottor W. French Andrson fece il primo tentativo di terapia genica per curare l'immunodeficienza combinata grave (SCID) in una bambina di tre anni, Ashanti da Silva. Questa malattia è causata da una mutazione nel gene che codifica per l'adenosanadenilasi (ADA). La carenza di questo enzima contribuisce all'accumulo di adenosina e deossiadenosina nel sangue, il cui effetto tossico porta alla morte dei linfociti B e T nel sangue periferico e, di conseguenza, all'immunodeficienza.

I bambini affetti da questa malattia devono essere protetti da eventuali infezioni (tenuti in apposite camere sterili), poiché qualsiasi malattia può essere fatale. Quattro anni dopo l'inizio del trattamento, la bambina ha mostrato l'espressione di un ADA normalmente funzionante e un sollievo dai sintomi della SCID, permettendole di lasciare la camera sterile e vivere una vita normale.

In questo modo è stata dimostrata la possibilità fondamentale di una terapia genetica di successo delle cellule somatiche. Dagli anni '90. La terapia genica è in fase di sperimentazione per una serie di malattie genetiche, comprese quelle gravi come l'emofilia, l'AIDS, vari tipi di neoplasie maligne, fibrosi cistica, ecc. Al momento, circa 10 malattie umane possono essere curate utilizzando la transgenesi.

La diversità delle malattie genetiche ha portato allo sviluppo di numerosi approcci di terapia genica. In questo caso vengono risolti 2 problemi principali: un mezzo per fornire il gene terapeutico; un metodo per garantire la somministrazione mirata alle cellule destinate alla correzione. Ad oggi, tutti gli approcci alla terapia genica delle cellule somatiche possono essere suddivisi in due categorie: terapia ex vivo e terapia in vivo (Fig. 3.15).

Riso. 3.15. Schema di terapia genica ex vivo (a) e in vivo (a)

La terapia genica ex vivo prevede la correzione genetica delle cellule difettose all’esterno del corpo e il successivo ripristino delle cellule normalmente funzionanti nel corpo.

La terapia genica in vivo prevede la somministrazione di un gene terapeutico direttamente nelle cellule di uno specifico tessuto del paziente. Diamo un'occhiata a questi approcci in modo più dettagliato.

La terapia genica ex vivo comprende le seguenti fasi:
1) ottenere cellule difettose dal paziente e coltivarle;
2) trasferimento del gene desiderato in cellule isolate mediante trasfezione di un costrutto genetico terapeutico;
3) selezione ed espansione di cellule geneticamente corrette;
4) trapianto o trasfusione di queste cellule al paziente.

L'utilizzo delle cellule del paziente garantisce che non sviluppino una risposta immunitaria quando vengono restituite. La procedura di trasferimento del costrutto genetico deve essere efficiente e il gene normale deve essere mantenuto stabilmente ed espresso in modo continuo.

I mezzi di trasferimento genico creati dalla natura stessa sono i virus. Per ottenere vettori efficaci per la consegna dei geni, vengono utilizzati principalmente due gruppi di virus: adenovirus e retrovirus (Fig. 3.16). Nella terapia genica vengono utilizzate varianti di virus geneticamente neutralizzati.

Riso. 3.16. Virus utilizzati per creare vettori terapeutici

Consideriamo la progettazione e l'uso di progetti basati sui retrovirus. Ricordiamo che il genoma di un retrovirus è rappresentato da due molecole identiche di RNA a filamento singolo, ciascuna delle quali è composta da sei sezioni: due ripetizioni terminali lunghe (LTR) alle estremità da 5" e 3", la sequenza non codificante * P+, necessaria per impacchettare l'RNA nella particella virale, e tre regioni che codificano la proteina strutturale del capside interno (gag), la trascrittasi inversa (pol) e la proteina dell'involucro (env) (Fig. 3.17a).

Riso. 3.17. Mappa genetica di un tipico retrovirus (a) e mappa di un vettore retrovirale (a)

Ricordiamo che il ciclo vitale di un retrovirus comprende le seguenti fasi:
1. Infezione delle cellule bersaglio.
2. Sintesi di una copia del DNA del genoma utilizzando la propria trascrittasi inversa.
3. Trasporto del DNA virale nel nucleo.
4. Incorporazione del DNA virale nel cromosoma della cellula ospite.
5. Trascrizione dell'mRNA dal DNA virale sotto il controllo di un forte promotore localizzato nella regione 5"-LTR.
6. Traduzione delle proteine Gag, Pol ed Env.
7. Formazione del capside virale e confezionamento di due catene di RNA e molecole di trascrittasi inversa.
8. Rilascio di virioni dalla cellula.

Quando si ottiene un vettore retrovirale, il DNA a lunghezza intera del retrovirus viene inserito in un plasmide, la maggior parte del gene gag e tutti i geni pol ed env vengono rimossi e al loro posto viene inserito un gene T "terapeutico" e, se necessario , viene inserito un gene marcatore selettivo Rg con il proprio promotore (Fig. 3.17, b ). La trascrizione del gene T sarà controllata dallo stesso forte promotore localizzato nella regione 5"-LTR. Sulla base di questo schema sono stati creati vari vettori retrovirali e una dimensione massima dell'inserto di DNA di circa 8mila bp.

Il costrutto così ottenuto può essere esso stesso utilizzato per la trasformazione, ma la sua efficienza e la successiva integrazione nel genoma della cellula ospite sono estremamente basse. Pertanto, è stata sviluppata una tecnica per impacchettare l'RNA a lunghezza intera di un vettore retrovirale in particelle virali intatte, che penetrano nella cellula con alta frequenza e sono garantite per essere integrate nel genoma ospite. A questo scopo è stata creata una linea cellulare cosiddetta “packaging”. In due diverse sezioni dei cromosomi di queste cellule sono incorporati i geni retrovirali gag e pol-env, privati della capacità di impaccarsi per la mancanza della sequenza + (84*+) (Fig. 3.18).

Riso. 3.18. Schema per ottenere un vettore virale confezionato

Cioè, entrambi questi frammenti vengono trascritti, ma si formano capsidi vuoti privi di RNA. Quando l'RNA vettore virale viene trasfettato in tali cellule, viene integrato nel DNA cromosomico e trascritto per formare RNA retrovirale a lunghezza intera, e in tali condizioni solo l'RNA vettore viene confezionato nei capsidi (solo esso contiene la sequenza +). Le particelle virali intatte risultanti vengono utilizzate per il rilascio efficiente del vettore retrovirale alle cellule bersaglio.

I retrovirus infettano attivamente solo le cellule che si dividono rapidamente. Per trasferire i geni, questi vengono trattati con particelle purificate del vettore retrovirale confezionato o co-coltivate con la linea cellulare che li produce, e quindi selezionate per separare le cellule bersaglio dalle cellule confezionate.

Le cellule trasdotte vengono attentamente controllate per quanto riguarda il livello di sintesi del prodotto genetico terapeutico, l'assenza di retrovirus competenti per la replicazione e l'assenza di cambiamenti nella capacità delle cellule di crescere o funzionare.

Le cellule del midollo osseo sono le più adatte per la terapia genica. Ciò è dovuto alla presenza di cellule staminali embrionali totipotenti, che possono proliferare e differenziarsi in vari tipi di cellule: linfociti B e T, macrofagi, eritrociti, piastrine e osteoclasti. Sono queste cellule che vengono utilizzate per trattare una serie di malattie ereditarie, tra cui la già menzionata immunodeficienza combinata grave, la malattia di Gaucher, l'anemia falciforme, la talassemia, l'osteoporosi, ecc.

Oltre alle cellule staminali totipotenti del midollo osseo, difficili da isolare e coltivare, vengono utilizzate cellule staminali del sangue del cordone ombelicale (l'uso preferito per la terapia genica nei neonati) e cellule del fegato - epatociti - per trattare l'ipercolesterolemia.

Nella terapia genica in vivo è particolarmente importante garantire la consegna del gene terapeutico alle cellule difettose. Tale consegna mirata può essere fornita da vettori modificati creati sulla base di virus in grado di infettare tipi specifici di cellule. Consideriamo l'approccio sviluppato per il trattamento della fibrosi cistica già menzionato sopra. Poiché i polmoni sono una cavità aperta, è relativamente facile fornire loro geni terapeutici. La versione clonata del gene sano è stata introdotta in un adenovirus inattivato (Fig. 3.19). La specificità di questo tipo di virus è che infetta il rivestimento dei polmoni provocando il raffreddore.

Riso. 3.19. Schema per ottenere un vettore basato sull'adenovirus

Il virus così costruito è stato testato spruzzandolo nel naso e nei polmoni di animali da esperimento e poi su pazienti umani. In alcuni casi sono stati osservati l'introduzione e l'espressione di un gene sano e il ripristino del normale trasporto degli ioni cloruro. È possibile che questo approccio (l’introduzione di un gene normale mediante spray nasali) venga ampiamente utilizzato nel prossimo futuro per trattare i sintomi della fibrosi cistica nei polmoni.

Oltre ai retrovirus e agli adenovirus, negli esperimenti di terapia genica vengono utilizzati anche altri tipi di virus, ad esempio il virus Herpes simplex. Una caratteristica speciale di questo virus del DNA a doppio filamento (152 kb) è la sua capacità di infettare specificamente i neuroni. Sono note molte malattie genetiche che colpiscono il sistema nervoso centrale e periferico: tumori, disordini metabolici, malattie neurodegenerative (morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson).

Il virus dell’herpes simplex di tipo I (HSV) è un vettore molto adatto per il trattamento di tali malattie. Il capside di questo virus si fonde con la membrana del neurone e il suo DNA viene trasportato nel nucleo. Sono stati proposti diversi metodi per trasferire un gene terapeutico utilizzando vettori HSV e sono stati condotti test con successo su animali da esperimento.

I vettori virali presentano diversi svantaggi: costo elevato, capacità di clonazione limitata e possibile risposta infiammatoria. Così, nel 1999, a seguito dello sviluppo di una risposta immunitaria insolitamente forte all'introduzione di un vettore adenovirale, morì un volontario di 18 anni che prese parte a studi farmacologici. Nel 2002, due bambini in Francia hanno sviluppato una condizione simile alla leucemia mentre erano in cura per un’immunodeficienza (introducendo geni terapeutici nelle cellule staminali utilizzando retrovirus).

Pertanto, si stanno sviluppando sistemi di rilascio di geni non virali. Il modo più semplice e inefficace è iniettare il DNA plasmidico nei tessuti. Il secondo approccio consiste nel bombardare i tessuti con microparticelle d'oro (1-3 micron) coniugate al DNA. In questo caso, i geni terapeutici vengono espressi nei tessuti bersaglio e i loro prodotti, le proteine terapeutiche, entrano nel sangue. Lo svantaggio principale di questo approccio è l’inattivazione o la distruzione prematura di queste proteine da parte dei componenti del sangue.

Il DNA può essere consegnato confezionandolo in un guscio lipidico artificiale. Le particelle sferiche di liposomi così ottenute penetrano facilmente nella membrana cellulare. Sono stati creati liposomi con diverse proprietà, ma finora l’efficienza di tale rilascio è bassa, poiché la maggior parte del DNA è soggetta alla distruzione lisosomiale. Inoltre, per fornire un costrutto genetico, i coniugati del DNA vengono sintetizzati con varie molecole che possono garantirne la sicurezza, la consegna mirata e la penetrazione nella cellula.

Negli ultimi anni sono stati condotti intensi esperimenti per creare un cromosoma artificiale 47, che consentirebbe di includere una grande quantità di materiale genetico con un set completo di elementi regolatori per uno o più geni terapeutici. Ciò consentirebbe di utilizzare una variante genomica di un gene terapeutico e di garantirne così la stabilità e l'efficace espressione a lungo termine. Gli esperimenti hanno dimostrato che la creazione di un cromosoma umano artificiale contenente geni terapeutici è del tutto possibile, ma non è ancora chiaro come introdurre una molecola così enorme nel nucleo di una cellula bersaglio.

Le principali sfide che la terapia genica deve affrontare, oltre al rischio di una grave reazione immunitaria, sono le difficoltà di conservazione e funzionamento a lungo termine del DNA terapeutico nel corpo del paziente, la natura multigenica di molte malattie, che le rende bersagli difficili per la terapia genica e il rischio di utilizzare virus come vettori.

SUL. Voinov, T.G. Volova

Circa duecento milioni di persone sul pianeta sono potenziali candidati alla terapia genica e diverse migliaia sono già diventati pazienti pionieri e hanno ricevuto cure per malattie precedentemente incurabili nell’ambito di sperimentazioni. Candidato di scienze mediche, medico generico presso il Laboratorio di medicina rigenerativa del Centro medico dell'Università statale di Mosca, ricercatore senior presso la Facoltà di medicina fondamentale dell'Università statale di Mosca, vincitore delle "Battaglie scientifiche" del Politecnico - 2015 Pavel Makarevich ha spiegato a T&P come funziona la terapia genica e quali problemi affrontano gli scienziati quando sviluppano questo metodo fondamentalmente diverso per trattare molte malattie gravi.

Pavel Makarevich

200 milioni di potenziali candidati sono tanti. Fino alla metà dei casi in cui la terapia genica aiuta sono malattie ereditarie: emofilia, immunodeficienze, malattie da accumulo, enzimopatie, il 25-30% dei casi sono malattie oncologiche, il restante 20% sono tutto il resto: cardiologia, neurologia, malattie del il sistema nervoso e persino traumi, come danni ai nervi o altri casi più gravi. Questa distribuzione è dovuta al fatto che le malattie ereditarie sono estremamente difficili e spesso fatali e in linea di principio non esiste altro trattamento, ad eccezione della terapia genica.

Come principio attivo terapeutico nella terapia genica viene utilizzata l'informazione genetica, ovvero le molecole che la trasportano: gli acidi nucleici RNA (meno spesso) e DNA (più spesso). Ogni cellula ha una “copiatrice” – un apparato di espressione – un meccanismo attraverso il quale la cellula traduce le informazioni genetiche in proteine che le permettono di funzionare correttamente. Lo stato in cui esiste il gene corretto e una "fotocopiatrice" ben funzionante (che, in effetti, dovrebbe sempre funzionare, altrimenti tale cellula non è vitale), dal punto di vista della terapia genica può essere condizionatamente definita salute di la cellula. Ogni cellula ha una libreria completa di questi geni principali, geni che la cellula utilizza per la corretta espressione proteica e il normale funzionamento. Con la patologia sono possibili una varietà di situazioni. Ad esempio, quando per qualche motivo un importante originale (gene) o la maggior parte di esso viene perso e non è più possibile ripristinare tale perdita. In una situazione del genere si sviluppano malattie come la distrofia muscolare di Duchenne, che porta alla paralisi progressiva di tutti i muscoli del corpo e termina con la morte all'età di 25-27 anni, solitamente per arresto respiratorio.

Un altro esempio è un piccolo "guasto", non così fatale, ma che porta comunque al fatto che questa proteina non funziona - non adempie alla sua funzione biologica. E se questo è, ad esempio, il fattore VIII della coagulazione del sangue, la persona sviluppa l'emofilia. In entrambe queste situazioni, il nostro compito è quello di fornire una copia funzionante “normale” del gene nel tessuto, cioè inserire l’originale corretto in questa “fotocopiatrice” per migliorare il funzionamento della cellula e, forse, tutto l’organismo, prolungandone così la vita. Funziona? Sì, tali approcci sono efficaci negli esperimenti sugli animali e sono già in fase di sperimentazione clinica sui pazienti, anche se bisogna ammettere che ci sono molte difficoltà lungo il percorso.

Stiamo anche sviluppando approcci per trattare le malattie ischemiche, che sono molto più comuni delle malattie ereditarie, anche se esistono senza dubbio molti altri trattamenti per queste malattie. Il fatto è che ogni persona che soffre di malattie coronariche o degli arti prima o poi si ritrova in uno stato in cui l'unico trattamento per lui può essere la terapia genica.

La terapia genica viene utilizzata per trattare un ampio gruppo di malattie associate a danni al sistema nervoso centrale: morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer, sclerosi laterale amiotrofica. Esistono virus che hanno la tendenza ad attaccare il sistema nervoso centrale e questa proprietà può essere utilizzata a fin di bene. Ad esempio, il virus dell'herpes vive nei nervi e con il suo aiuto possono essere forniti al sistema nervoso fattori di crescita e citochine che rallentano la progressione di queste malattie. Questo è proprio un esempio di quando un virus che provoca una malattia viene modificato, privato delle proteine responsabili della sua azione patogena, e utilizzato come cassetta, e i fattori di crescita proteggono i neuroni dalla morte, che avviene in queste malattie e provoca la morte del paziente. Pertanto, risulta che i virus che trasportano i geni del fattore di crescita rallentano la progressione della malattia e prolungano la vita del paziente.

Oppure, ad esempio, la cecità è una condizione che priva completamente una persona di immagini visive per tutta la vita. Una delle cause della cecità è la cosiddetta atrofia congenita di Leber, che si sviluppa a causa di una mutazione nel gene RPE 65. Nel mondo, circa 80 persone hanno ormai acquisito capacità visive minime grazie alla terapia genica, un adenovirus modificato che ha trasportato l'RPE 65 “funzionante” al tessuto oculare e ne ha aumentato la sensibilità alla luce.

Come forniamo le informazioni genetiche ai tessuti: localmente, a un organo specifico o all'intero corpo contemporaneamente? Ci sono due opzioni. Il primo è un plasmide, cioè una molecola di DNA circolare. Si avvolge, diventa molto piccolo e compatto e lo “impacchettamo” in una sorta di polimero chimico per facilitare la penetrazione nella cellula. Qual è il problema qui? Il DNA plasmidico verrà rimosso dalla cellula dopo 12-14 giorni e la produzione di proteine verrà interrotta. In una situazione del genere, possiamo prendere due decisioni: la prima è introdurre una dose aggiuntiva di DNA plasmidico (fortunatamente non è immunogenico), la seconda è introdurre lì più geni contemporaneamente (ad esempio, per potenziare gli effetti di citochine sulla rigenerazione dei tessuti) al fine di aumentare la forza d'azione in quel breve periodo di tempo durante il quale avverrà la produzione di proteine.

Un'altra via d'uscita (ne abbiamo già parlato sopra) sono i virus. Inizialmente, i virus sono particelle patogene che causano malattie, ma nel nostro caso possono anche essere utilizzate per fornire informazioni genetiche alle cellule. Utilizzando metodi di ingegneria genetica possiamo eliminare dal virus le proteine responsabili della sua azione patogena, lasciandogli solo il necessario per penetrare nella cellula e caricarla delle informazioni di cui abbiamo bisogno. Quindi il virus si trasforma da arma in una cassetta per fornire informazioni genetiche utili e terapeutiche.

Si scopre che abbiamo due metodi molto potenti di trasferimento genico e il virus sembra chiaramente più preferibile perché può trovare da solo i suoi bersagli nel corpo: ad esempio, il virus dell'epatite troverà il fegato e il virus dell'herpes troverà i neuroni . Il plasmide, il DNA circolare, funziona solo dove è inserito. Sorge la domanda: perché usiamo ancora i plasmidi se ci sono virus? La risposta è: i virus sono immunogeni, causano una risposta immunitaria. E, in alternativa, possono essere distrutti dal sistema immunitario prima che possano funzionare o, nella peggiore delle ipotesi, possono causare effetti collaterali: potenti reazioni immunitarie all’introduzione del virus. Risulta essere un equilibrio molto fragile tra efficacia e sicurezza, che determina il destino dei farmaci che sviluppiamo, e se il farmaco si rivela pericoloso in fase di sviluppo, questo è un vicolo cieco.

Per sviluppare, ottenere e testare un nuovo farmaco per la terapia genica, un laboratorio o addirittura un intero istituto deve lavorare per diversi anni. Questo, per usare un eufemismo, non è economico, mentre si tratta di una produzione una tantum, e i protocolli, se non sono sponsorizzati dallo sviluppatore, sono molto costosi. Ci sono due o tre farmaci registrati in Europa, uno in Giappone e in Russia finora solo uno: Neovasculgen, un farmaco per stimolare la crescita vascolare.

I farmaci utilizzati per la terapia genica hanno una farmacocinetica e una farmacodinamica precedentemente non studiate. Il problema è che al momento sono state accumulate pochissime informazioni a riguardo rispetto a quelle che si trovano sui farmaci convenzionali. Ciò significa che tutti i rischi associati alla terapia genica dovrebbero teoricamente essere presi in considerazione durante lo sviluppo. Diciamo che sappiamo che non abbiamo bisogno di testare nella pratica mille volte la dose di aspirina, e non lo facciamo. Per quanto riguarda la terapia genica, poiché non conosciamo ancora la farmacocinetica (e quindi molte caratteristiche dell'azione dei farmaci), dobbiamo tenere conto di tutti i possibili effetti esistenti, e questo allunga molto lo studio nel tempo.

Il secondo problema è che ogni farmaco ha la sua modalità d’azione unica. Ciò significa che è necessario dimostrarne la sicurezza e l’efficacia in modelli unici, e questo allunga anche il periodo dopo il quale si può dire: “Sì, il farmaco può essere portato in clinica o sul mercato, ed è sicuro”. Pertanto, credo che questa sia in gran parte una questione di tempo e di esperienza umana in quest'area, che, come in ogni sviluppo di farmaci, si accumulerà a costo di grossi problemi: interruzione della ricerca, effetti collaterali. Ma so anche che si tratta del risultato del lavoro di centinaia di ricercatori e che ha il potenziale per aiutare milioni di persone. Attualmente l’esperienza è già stata accumulata e sono state apprese alcune lezioni che ci aiutano ad andare avanti.