Co ukazuje Coombsův test při anémii? Autoimunitní hemolytické anémie

Protilátky, umístěné na povrchu erytrocytů, mohou být buď ve statickém, nebo volném stavu v krevní plazma. V závislosti na stavu protilátek se provádí přímá nebo nepřímá Coombsova reakce. Pokud existuje důvod se domnívat, že protilátky jsou fixovány na povrchu červených krvinek, provede se přímý Coombsův test. Test v tomto případě probíhá v jedné fázi – sčítání antiglobulinové sérum. Pokud jsou na povrchu červených krvinek přítomny neúplné protilátky, aglutinacečervené krvinky

Nepřímá reakce

Nepřímá Coombsova reakce probíhá ve 2 fázích. Nejprve je třeba uměle implementovat senzibilizacečervené krvinky K tomu se inkubují červené krvinky a testované krevní sérum, což způsobí fixaci protilátek na povrchu červených krvinek. Poté se provede druhá fáze Coombsova testu - přidání antiglobulinového séra.

Srážková reakce - RP (z lat. praecipilo sraženina) je tvorba a precipitace komplexu rozpustného molekulárního antigenu s protilátkami ve formě zákalu tzv. sraženina. Vzniká smícháním antigenů a protilátek v ekvivalentních množstvích, nadbytek jednoho z nich snižuje úroveň tvorby imunitního komplexu. Precipitační reakce se provádí ve zkumavkách (kroužková precipitační reakce), v gelech, živných médiích atd. Odrůdy srážecí reakce v polotekutém agaru nebo agarózovém gelu, dvojitá imunodifúze tzv. Ouchterlony, radiap imunodifuze, imunoepektroforéza atd.

HLA typizace- studium lidského hlavního histokompatibilního komplexu - HLA komplexu. Tato formace zahrnuje oblast genů na chromozomu 6, které kódují HLA antigeny zapojené do různých imunitních reakcí.

Úkoly pro HLA typizace může být velmi rozdílná – biologická identifikace (typ HLA se dědí spolu s rodičovskými geny), stanovení predispozice k různým onemocněním, výběr dárců pro transplantaci orgánů – v tomto případě jsou porovnány výsledky HLA typizace tkání dárce a příjemce. Pomocí HLA typizace se zjišťuje, jak podobní nebo odlišní jsou manželé z hlediska histokompatibilních antigenů, aby bylo možné diagnostikovat případy neplodnosti.

HLA typizace naznačuje Analýza polymorfismu HLA a provádí se dvěma metodami – sérologickou a molekulárně genetickou. Klasická sérologická metoda typizace HLA je založena na mikrolymfocytotoxickém testu a molekulární metoda využívá PCR (polymerázová řetězová reakce).

sérologické HLA typizace prováděné na izolovaných buněčných populacích. Antigeny hlavního histokompatibilního komplexu jsou neseny hlavně lymfocyty. Proto se jako hlavní nosiče antigenů třídy I používá suspenze T lymfocytů a pro stanovení antigenů HLA třídy II suspenze B lymfocytů. K izolaci požadovaných buněčných populací z plné krve se používá buď centrifugace, nebo imunomagnetická separace. Předpokládá se, že první metoda může vést k falešně pozitivním údajům, protože to vede ke smrti některých buněk. Druhá metoda je uznávána jako specifičtější – více než 95 % buněk zůstává životaschopných.

Ale základ pro provedení lymfocytotoxického testu HLA typizace je specifické sérum obsahující protilátky proti různým alelickým variantám antigenů HLA třídy I a II. Sérologický test může určit typ HLA tím, že zkoumá, která séra reagují s lymfocyty a která ne.

Pokud dojde k reakci mezi buňkami a sérem, výsledkem je vytvoření komplexu antigen-protilátka na povrchu buňky. Po přidání roztoku obsahujícího komplement dochází k buněčné lýze a smrti. Sérologický test typizace HLA se hodnotí pomocí fluorescenční mikroskopie k vyhodnocení pozitivních (červená fluorescence) a negativních (zelená fluorescence) reakcí nebo mikroskopie s fázovým kontrastem k obarvení jader mrtvých buněk. Výsledek typizace HLA je odvozen s přihlédnutím ke specifitě zreagovaného séra a zkříženě reagujících skupin antigenů a intenzitě cytotoxické reakce.

Nevýhody sérologického HLA typizace jsou přítomnost zkřížených reakcí, slabá afinita protilátek nebo nízká exprese HLA antigenů, nepřítomnost proteinových produktů v řadě HLA genů.

Modernější, molekulární metody HLA typizace používají již standardizované syntetické vzorky, které nereagují s antigeny na povrchu leukocytů, ale s DNA a přímo indikují, které antigeny jsou ve vzorku přítomny. Molekulární metody nevyžadují živé bílé krvinky, studovat lze jakoukoli lidskou buňku a k práci stačí pár mikrolitrů krve, nebo se můžete omezit na seškrabování z ústní sliznice.

Molekulární genetika HLA typizace využívá metodu PCR, jejímž prvním krokem je získání čisté genomové DNA (z plné krve, suspenze leukocytů, tkání).

Vzorek DNA je poté zkopírován – amplifikován in vitro pomocí primerů (krátká jednovláknová DNA) specifických pro konkrétní HLA lokus. Konce každého páru primerů musí být přísně komplementární k jedinečné sekvenci odpovídající specifické alele, jinak nedojde k amplifikaci.

Po PCR se při opakovaném kopírování získá velké množství fragmentů DNA, které lze posoudit vizuálně. K tomu se reakční směsi podrobí elektrolýze nebo hybridizaci a pomocí programu nebo tabulky se určí, zda došlo ke specifické amplifikaci. Výsledek typizace HLA je prezentován ve formě komplexní zprávy na genové a alelické úrovni. Vzhledem ke standardizaci použitých vzorků molekulární HLA typizace přesněji sérologické. Navíc poskytuje více informací (více nových alel DNA) a vyšší úroveň detailů, protože umožňuje identifikovat nejen antigeny, ale i samotné alely, které určují, který antigen je na buňce přítomen.

Reakce imunitní lýzy. Reakce je založena na schopnosti specifických protilátek tvořit imunitní komplexy s buňkami včetně erytrocytů a bakterií, což vede k aktivaci komplementového systému po klasické dráze a buněčné lýze. Z imunitních lýzových reakcí se nejčastěji využívá reakce hemolytická a zřídka bakteriolýzní (hlavně při odlišení cholery a choleře podobných vibrií).

Reakce hemolýzy. Pod vlivem reakce s protilátkami v přítomnosti komplementu se zakalená suspenze červených krvinek změní na jasně červenou průhlednou kapalinu - „lakovou krev“ v důsledku uvolňování hemoglobinu. Při nastavování diagnostické reakce fixace komplementu (FFR) se hemolytická reakce používá jako indikátor: k testování přítomnosti nebo nepřítomnosti (fixace) volného komplementu.

Lokální hemolytická reakce v gelu(Erneova reakce) je jednou z variant hemolytické reakce. Umožňuje určit počet buněk tvořících protilátky. Počet buněk vylučujících protilátky - hemolyziny - je určen počtem hemolytických plaků, které se objevují v agarovém gelu obsahujícím erytrocyty, suspenzi buněk studované lymfoidní tkáně a komplementu.

Imunofluorescenční metoda

(RIF, imunofluorescenční reakce) je metoda pro detekci specifických Ag (Abs) pomocí Abs (Ags) konjugovaných s fluorochromem. Má vysokou citlivost a specificitu. Používá se pro expresní diagnostiku infekcí. onemocnění (identifikace patogenu ve výzkumném materiálu), dále pro stanovení Ab a povrchových receptorů a markerů leukocytů (imunofenotypizace) a dalších buněk. Přímý I. m. spočívá ve zpracování části tkáně nebo nátěru z patologického materiálu nebo mikrobiální kůry obsahující specifické Ab konjugované s fluorochromem; přípravek se promyje, aby se zbavil nenavázaných Abs a zkoumá se pod fluorescenčním mikroskopem. V pozitivních případech se kolem periferie objektu objeví zářící imunitní komplex. Kontrola je nezbytná k vyloučení nespecifické luminiscence. Na nepřímý. Jim. v první fázi se tkáňový řez nebo nátěr ošetří nefluorescenčním specifickým činidlem, ve druhé - luminiscenčním činidlem proti -globulinům zvířete, které bylo použito v první fázi. V kladném případě vzniká svítící komplex skládající se z Ar, At k němu a At proti At (sendvičová metoda). Kromě fluorescenčního mikroskopu se při fenotypizaci buněk bere v úvahu RIF. laserový třídič buněk .

Průtoková cytometrie- metoda optického měření parametrů buňky, jejích organel a procesů v ní probíhajících.

Tato technika zahrnuje detekci rozptylu světla z laserového paprsku, když jím buňka prochází v proudu kapaliny, a stupeň rozptylu světla umožňuje získat představu o velikosti a struktuře buňky. Kromě toho analýza bere v úvahu úroveň fluorescence chemických sloučenin, které jsou součástí buňky (autofluorescence) nebo přidané do vzorku před průtokovou cytometrií.

Buněčná suspenze, předem značená fluorescenčními monoklonálními protilátkami nebo fluorescenčními barvivy, vstupuje do proudu tekutiny procházející průtokovou kyvetou. Podmínky jsou voleny tak, aby se buňky seřadily jedna za druhou kvůli tzv. hydrodynamické zaměření paprsku v paprsku. V okamžiku, kdy buňka překročí laserový paprsek, detektory zaznamenají:

rozptyl světla pod malými úhly (od 1° do 10°) (tato charakteristika se používá k určení velikosti buněk).

rozptyl světla pod úhlem 90° (umožňuje nám posoudit poměr jádro/cytoplazma, stejně jako heterogenitu a zrnitost buněk).

intenzita fluorescence prostřednictvím několika fluorescenčních kanálů (od 2 do 18-20) - umožňuje určit složení subpopulace buněčné suspenze atd.

Coombsův test

Přímý Coombsův test je antiglobulinový test (aglutinace v gelu umožňující detekci kompletních divalentních protilátek), který detekuje protilátky třídy IgG a C3 složku komplementu na povrchu červených krvinek. Typicky mají protilátky detekované přímým Coombsovým testem širokou specifitu, která není spojena s dobře zavedeným antigenem. Pozitivní přímý Coombsův test jasně ukazuje, že pacient má hemolytickou anémii, i když ne všichni pacienti s pozitivním přímým antiglobulinovým testem trpí tímto onemocněním. Přibližně u 10 % pacientů nelze protilátky nebo složky komplementu na membráně červených krvinek stanovit přímým Coombsovým testem (test je negativní), přesto však trpí autoimunitní hemolytickou anémií. K objasnění specifity protilátek se v takových případech používají testy s jejich elucí. Přímý Coombsův test, pozitivní pouze na komplement, obvykle odkazuje na studené protilátky typu IgM. V tomto případě nejsou IgM protilátky přítomny na červených krvinkách při bazální tělesné teplotě. Vzhledem k tomu, že protilátky IgM aktivně fixují komplement a komplement zůstává na červených krvinkách, u této formy autoimunitní hemolytické anémie (nemoc studených aggutininů) bude Coombsův test pozitivní pouze na komplement.

Přímý Coombsův test je pozitivní na autoimunitní hemolytickou anémii způsobenou teplými protilátkami, autoimunitní lékem indukovanou anémii (při užívání methyldopy má pozitivní reakci až 20 % pacientů), lékově adsorpční typ hemolytické anémie, imunokomplexní typ hemolytika anémie (test je pozitivní pouze na C3), s autoimunitní hemolytickou anémií způsobenou chladovými protilátkami - nemoc chladových aglutininů (test je pozitivní pouze na C3). U paroxysmální studené hemoglobinurie je přímý Coombsův test negativní.
V akutním období onemocnění, v důsledku destrukce červených krvinek, na kterých bylo zaznamenáno velké množství protilátek, při hemolytické krizi, jakož i při nedostatečném počtu protilátek v chronickém průběhu onemocnění, negativní lze pozorovat přímý Coombsův test.

• Důležitou podmínkou pro zajištění kvality laboratorních krevních testů je odběr materiálu nalačno, ráno (do 12:00).
• 12 hodin před testem byste se měli vyvarovat pití alkoholu, kouření, jídla a omezení fyzické aktivity.
• Ráno v den krevního testu můžete pít vodu.
• Vyhněte se užívání léků; Pokud není možné přestat užívat léky, musíte informovat laboratoř.
• Je vhodné vzít materiál před provedením jakýchkoli lékařských diagnostických postupů.
• Při hodnocení hladiny hormonů u žen je důležité vzít v úvahu den menstruačního cyklu, kdy je nejoptimálnější měřit některé hormony. Tyto informace můžete získat od svého lékaře.

Coombsův test je laboratorní test prováděný ovlivněním hemaglutinace. Je založena na citlivosti protilátek k imunoglobulinům a enzymovým prvkům a také na jejich schopnosti aglutinovat erytrocyty potažené C3 nebo Lg.

Přímá Coombsova diagnostika

Používá se k detekci protilátek nebo komponent komplementu instalovaných na vnější straně buněk. Přímý Coombsův test se provádí následovně.

Použití takového vzorku

Přímá Coombsova diagnostika se používá v určitých případech, jako jsou:

• transfuzní účinky;
• autoimunitní hemolýza;
• hemolytická anémie způsobená léky.

Nepřímý Coombsův test

Tato diagnóza umožňuje detekovat protilátky proti buňkám v séru, které je inkubováno zpravidla s dárcovskými červenými krvinkami typu 0, a poté je proveden přímý test. Nepřímá Coombsova diagnostika se používá v následujících případech:

Jak se připravit na analýzu

Pro přípravu na zkoušku platí určitá pravidla.

1. Pokud je pacient novorozenec, rodiče si musí být vědomi toho, že test pomůže diagnostikovat hemolytické onemocnění novorozence.
2. Pokud má pacient podezření na hemolytickou anémii, je třeba mu vysvětlit, že analýza mu umožní zjistit, zda je způsobena ochrannými poruchami, léky nebo jinými faktory.
3. Coombsův test, přímý ani nepřímý, nečiní žádná omezení ve výživě nebo dietě.
4. Je nutné pacienta upozornit, že vyšetření bude vyžadovat odběr krve ze žíly, a také mu přesně sdělit, kdy bude venepunkce provedena.
5. Měli byste také varovat před pravděpodobností nepříjemných pocitů během období aplikace obvazu na paži a samotného postupu.
6. Léky, které mohou ovlivnit výsledek vzorku, by měly být vysazeny.

Mezi tyto léky patří:

• "Streptomycin";
• "Methyldopa";
• "Prokainamid";
• sulfonamidy;
• "Melfalan";
• "chinidin";
• "Rifampin";
• "Isoniazid";
• cefalosporiny;
• "Hydralazin";
• "chlorpromazin";
• "Levodopa";
• "tetracyklin";
• "difenylhydantoin";
• "Ethosuximid";
• "Penicilin";
• kyselina mefenamová.

Odběr krve se provádí ráno nalačno.

Jak se akce koná

Coombsův test se provádí v následujícím pořadí:

1. Při provádění diagnostiky u dospělého pacienta se po venepunkci odebírá krev do zkumavek s EDTA (ethylendiamintetraacetát).
2. Krev novorozence se odebírá z pupeční šňůry do kádinky obsahující EDTA.
3. Oblast vpichu se přitlačí vatovým tamponem, dokud se krvácení nezastaví.
4. Pokud se v místě venepunkce objeví modřina, předepisují se teplé obklady.
5. Po odběru krve je pacientovi umožněn návrat k užívání léků.
6. Je nutné informovat rodiče novorozence, že může být zapotřebí sekundární analýza pro sledování dynamiky anémie.

Výhody Coombsova testu

Takový výzkum má některé výhody, jmenovitě:

Nevýhody analýzy

Pozitivní Coombsův test je poměrně pracná vyšetřovací metoda, která vyžaduje charakteristickou přesnost provedení. Při jeho užívání se můžete setkat s určitými obtížemi, souvisejícími zejména s interpretací slabě pozitivních účinků.

Bylo zjištěno, že chybné negativní nebo slabě pozitivní reakce při výrobě Coombsových testů mohou být důsledky neuspokojivě aktivního mytí buněk, oslabení antiglobulinového činidla zbytky séra a také spojení s nemastnými povrchy, na kterých může antiglobulin opravit, čímž ztratí svou účinnost.

Coombsův test má ještě jednu nevýhodu - nízkou stabilitu antiglobulinového činidla, jehož získání a uchování má individuální charakteristiky, což obdobně znesnadňuje numerické posouzení vlivu antiglobulinového séra na hemaglutinaci.

Nemoci, které lze zjistit při vyšetření

Coombsova diagnostika umožňuje odhalit určité typy onemocnění, jako jsou:

• hemolytická malátnost novorozence;
• různé transfuzní reakce;
• autoimunitní hemolýza;
• hemolytická anémie způsobená léky.

Dnes je Coombsův test považován za poměrně populární systém krevních testů pro dospělé i novorozence. Umožňuje identifikovat mnoho různých onemocnění.

Na povrchu červených krvinek je velké množství antigenů. Podle typu těchto antigenů se rozlišují krevní skupiny, nejvíce studovanými skupinami jsou ABO, Rh, Kell, Duffy a mnoho dalších...

Průměrná cena ve vašem regionu: 2645 od 2645 do 2645

Ve vašem regionu provádí tuto analýzu 1 laboratoř

Popis studie

Příprava na studium: Krev se odebírá ze žíly a poté se sérum (krevní plazma bez fibrinogenu) získá přirozeným srážením nebo precipitací fibrinogenu. Testovací materiál: Odebírání krve

Na povrchu červených krvinek je velké množství antigenů. Podle typu těchto antigenů se rozlišují krevní skupiny, nejvíce studovanými skupinami jsou ABO, Rh, Kell, Duffy a mnoho dalších systémů. Normálně jsou v krvi protilátky proti antigenům jiné skupiny, ale při krevní transfuzi, těhotenství, autoimunitních onemocněních atd. se zjišťují protilátky proti vlastním antigenům Nekompletní protilátky proti červeným krvinkám

Metoda

Nepřímá Coombsova reakce je založena na detekci aglutinace (shlukování) červených krvinek, které mají na povrchu neúplné protilátky, která se objeví po přidání antiglobulinového séra.

V první fázi se do jedné zkumavky přidají červené krvinky dárce (skupina O(I), Rh+) ​​a testovací sérum. Pokud jsou v testovacím séru přítomny neúplné protilátky proti červeným krvinkám, pak jsou fixovány na povrchu dárcovských červených krvinek.

Ve druhé fázi se na sklo aplikují dárcovské červené krvinky s protilátkami (pokud existují) a standardní antiglobulinové sérum s protilátkami proti lidským imunoglobulinům. Pokud jsou v první fázi na povrchu červených krvinek fixovány protilátky proti červeným krvinkám, pak po přidání standardního séra se červené krvinky slepí pohromadě díky interakci protilátek.

Referenční hodnoty - norm
(Nepřímý Coombsův test (antiglobulinový test, detekce nekompletních antierytrocytárních protilátek), krev)

Informace týkající se referenčních hodnot indikátorů a také složení indikátorů zahrnutých do analýzy se mohou v závislosti na laboratoři mírně lišit!

Norma:

Normálně by neměly existovat žádné protilátky proti vlastním červeným krvinkám; když se provádí Coombsův test, nedochází k agregaci červených krvinek.

Indikace

Studium humorální specifické imunity v případech podezření na autoimunitní reakce v těle, Rh konflikt mezi matkou a plodem, stanovení krevní kompatibility mezi dárcem a příjemcem

Zvyšování hodnot (pozitivní výsledek)

Protilátky proti červeným krvinkám jsou detekovány, když:

1. Autoimunitní hemolytická anémie

2. Hemolytická nemoc novorozence

3. Systémová onemocnění pojiva

4. Chronická aktivní hepatitida atp.

Antiglobulinový princip. Antierytrocytární protilátky nekompletního typu a molekuly komplementu (C) umístěné na povrchu erytrocytů se detekují - přímým testem - jejich aglutinací v kontaktu se zvířecím sérem obsahujícím protilátky proti lidskému antiglobulinu (antiglobulinové sérum). Nekompletní protilátky volné v séru se detekují – nepřímým testem – jejich navázáním na směs normálních červených krvinek skupiny 0, jejichž všechny antigeny patří do známého Rh systému, a následně se aglutinují vlivem antiglobulinového séra.

Materiály, činidla pro Coombsův antiglobulinový test: zkumavky 10/100 ml; odměrné pipety 1,2 ml; Pasteurovy pipety; stativy; nebroušená skleněná sklíčka; 8,5‰ roztok NaCl; červené krvinky. Červené krvinky pacienta, stejně jako ty, které patří do skupiny 0, budou získány z čerstvě odebrané krve pomocí protisrážlivého činidla (roztok EDTA).

Červené krvinky skupiny 0 by měly být vybrány tak, aby pocházely od normálních jedinců a obsahovaly všechny Rh antigeny. Mohou být skladovány až 7 dní v autologní plazmě při + 4°C. V nepřítomnosti červených krvinek skupiny 0 lze použít známou antigenní mozaiku, směs červených krvinek skupiny 0, Rh-pozitivních a Rh-negativních červených krvinek.

Sérum pacient musí být čerstvě vybrán.

Antiglobulinové sérum produkoval Ústav. Dr. I. Cantacuzino, je dostupný v lyofilizované formě v 1 ml ampulích. Po rozpuštění uchovávejte sérum při -20°C.

Coombsova antiglobulinová testovací technika:
A) Přímý Coombsův test: Opláchněte pacientovy červené krvinky 3x roztokem 8,5‰ NaCl.
Naneste velkou kapku ředění antiglobulinového séra na několik podložních sklíček a vedle ní malou kapku erytrocytárního sedimentu pacienta; smíchejte kapky s rohem sklenice. Připravený materiál ponechte na stole 5 minut, poté zkontrolujte přítomnost aglutinátů. Pokud je výsledek pozitivní, určete maximální aglutinační titr.

b) Nepřímý Coombsův test: erytrocyty skupiny 0, Rh-pozitivní a Rh-negativní, 3x opláchněte 8,5‰ roztokem NaCl a vystavte pacientovu séru rychlostí 2 kapky erytrocytů na 8-10 kapek séra, poté inkubujte 60 minut při teplotu 37° S. Poté znovu třikrát promyjte červené krvinky a ošetřete je antiglobulinovým sérem podle pokynů pro přímý Coombsův test.

Kdy to přijde o chladově aktivních protilátkách senzibilizovat červené krvinky skupiny 0 po dobu 60 minut. při teplotě + 4°C.

Poznámka 1) Neprovádějte přímý Coombsův test na červených krvinkách skladovaných po dobu jednoho nebo několika dnů při + 4 °C nebo pokojové teplotě, protože výsledky mohou být falešně pozitivní kvůli fixaci neúplných chladově aktivních protilátek přítomných v normálním séru. 2) V případě těžké hyperproteinémie promyjte 4-5x červené krvinky a pomocí kyseliny sulfosalicylové zkontrolujte nepřítomnost sérových proteinů v poslední promývací kapalině.

Možný zbytek 2 μg IgG/ml v sedimentu erytrocytů může neutralizovat antiglobulinové sérum. Coombsův test lze také provést s použitím monospecifických anti-IgG, -IgM, -IgA -C3 a -C4 sér za účelem objasnění typu buněk umístěných na povrchu červených krvinek, například u pacientů trpících autoimunitními hemolytickými anémie.