Рекомбінантний інтерферон альфа 2b у розчині. Все про ліки

Форма випуску, склад та упаковка

Розчин для ін'єкцій прозорий, безбарвний.

Допоміжні речовини:

0.5 мл - ампули (5) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
0.5 мл - ампули (5) - упаковки коміркові контурні (2) - пачки картонні.
0.5 мл - флакони (1) - картонні пачки.
0.5 мл - флакони (5) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
0.5 мл - шприци скляні (1) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
0.5 мл - шприци скляні (1) - упаковки коміркові контурні (3) - пачки картонні.
0.5 мл - шприци скляні (3) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
0.5 мл - шприци скляні (3) - упаковки коміркові контурні (3) - пачки картонні.

Розчин для ін'єкцій прозорий, безбарвний.

Допоміжні речовини:натрію ацетат, хлорид натрію, етилендіамін тетраоцтової кислоти динатрієва сіль, твін-80, декстран 40, вода д/і.

1 мл - ампули (5) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
1 мл - ампули (5) - упаковки коміркові контурні (2) - пачки картонні.
1 мл - флакони (1) - картонні пачки.
1 мл - флакони (5) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
1 мл - шприци скляні (1) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
1 мл - шприци скляні (1) - упаковки коміркові контурні (3) - пачки картонні.
1 мл - шприци скляні (3) - упаковки коміркові контурні (1) - пачки картонні.
1 мл - шприци скляні (3) - упаковки коміркові контурні (3) - пачки картонні.

Клініко-фармакологічна група

Інтерферон. Протипухлинний, противірусний та імуномодулюючий препарат

Фармакологічна дія

Інтерферон. Альтевір ® має противірусну, імуномодулюючу антипроліферативну та протипухлинну дію.

Інтерферон альфа-2b, взаємодіючи зі специфічними рецепторами на поверхні клітини, ініціює складний ланцюг змін усередині клітини, що включає індукцію синтезу ряду специфічних цитокінів і ферментів, порушує синтез вірусної РНК і білків вірусу в клітині. Результатом цих змін є неспецифічна противірусна та антипроліферативна активність, пов'язана з запобіганням реплікації вірусу в клітині, гальмуванням проліферації клітин та імуномодулюючою дією інтерферону. Інтерферон альфа-2b стимулює процес презентації антигену імунокомпетентним клітинам, має здатність стимулювати фагоцитарну активність макрофагів, а також цитотоксичну активність Т-клітин та "натуральних кілерів", що беруть участь у противірусному імунітеті.

Запобігає проліферації клітин, особливо пухлинних. Чинить вплив на синтез деяких онкогенів, що призводить до інгібування пухлинного росту.

Фармакокінетика

Всмоктування

При підшкірному або внутрішньом'язовому введенні інтерферону альфа-2b його біодоступність становить від 80% до 100%. Після введення інтерферону альфа-2b Тmax у плазмі крові становить 4-12 год, T 1/2 - 2-6 год. Через 16-24 год після введення рекомбінантний інтерферон у сироватці крові не визначається.

Метаболізм

Метаболізм здійснюється у печінці.

Інтерферони альфа здатні порушувати окисні метаболічні процеси, знижуючи активність мікросомальних ферментів печінки системи цитохрому Р450.

Виведення

Виводиться переважно нирками шляхом клубочкової фільтрації.

Показання для застосування препарату

У складі комплексної терапії у дорослих:

- при хронічному вірусному гепатиті без ознак цирозу печінки;

- при хронічному вірусному гепатиті С без симптомів печінкової недостатності (монотерапія або комбінована терапія з рибавірином);

- При папіломатозі гортані;

- При гострих кондиломах;

— при волосатоклітинному лейкозі, хронічному мієлолейкозі, неходжкінській лімфомі, меланомі, множинні мієломи, саркомі Капоші на фоні СНІД, що прогресує рак нирки.

Режим дозування

Застосовують підшкірно, внутрішньом'язово і внутрішньовенно. Лікування має бути розпочато лікарем. Далі з дозволу лікаря пацієнт може вводити собі підтримуючу дозу самостійно (у випадках, коли препарат призначений підшкірно або внутрішньом'язово).

Хронічний гепатит В:Альтевір ® вводять підшкірно або внутрішньом'язово в дозі 5-10 млн. ME 3 рази на тиждень протягом 16-24 тижнів. Лікування припиняють після 3-4 місяців застосування за відсутності позитивної динаміки (за даними дослідження ДНК вірусу гепатиту В).

Хронічний гепатит С:Альтевір ® вводять підшкірно або внутрішньом'язово в дозі 3 млн. ME 3 рази на тиждень протягом 24-48 тижнів. У пацієнтів з рецидивуючим перебігом захворювання та хворих, які раніше не отримували лікування інтерфероном альфа-2b, ефективність лікування збільшується при комбінованій терапії з рибавірином. Тривалість комбінованої терапії становить щонайменше 24 тижнів. Терапію Альтевіром слід проводити 48 тижнів хворим на хронічний гепатит С і 1-й генотип вірусу з високим вірусним навантаженням, у яких до кінця перших 24 тижнів лікування в сироватці крові не визначається РНК вірусу гепатиту С.

Папіломатоз гортані:Альтевір ® вводять підшкірно в дозі 3 млн. МО/м 2 3 рази на тиждень. Лікування починають після хірургічного (або лазерного) видалення пухлинної тканини. Дозу підбирають з урахуванням переносимості препарату. Досягнення позитивної відповіді може вимагати лікування протягом 6 місяців.

Волосатоклітинний лейкоз:рекомендована доза Альтевіру для підшкірного введення пацієнтам після спленектомії або без неї становить 2 млн. МО/м 2 3 рази на тиждень. Найчастіше нормалізація одного і більше гематологічних показників настає через 1-2 місяці лікування, можливе збільшення термінів лікування до 6 місяців. Цього режиму дозування слід дотримуватись постійно, якщо при цьому не відбувається швидкого прогресування захворювання або виникнення симптомів тяжкої непереносимості препарату.

Хронічний мієлолейкоз:рекомендована доза Альтевіра як монотерапія - 4-5 млн. МО/м 2 щодня п/к щодня. Для підтримки кількості лейкоцитів може бути потрібне застосування в дозі 0.5-10 млн. МО/м 2 . Якщо лікування дозволяє досягти контролю кількості лейкоцитів, то для підтримки гематологічної ремісії препарат слід застосовувати в максимальній дозі, що переноситься (4-10 млн. МО/м 2 щодня). Препарат необхідно відмінити через 8-12 тижнів, якщо терапія не призвела до часткової гематологічної ремісії або клінічно значимого зниження кількості лейкоцитів.

Неходжкінська лімфома:Альтевір ® застосовують як ад'ювантну терапію в комбінації зі стандартними схемами хіміотерапії. Препарат вводять підшкірно в дозі 5 млн. МО/м 2 3 рази на тиждень протягом 2-3 місяців. Дозу слід коригувати залежно від переносимості препарату.

Меланома:Альтевір ® застосовують як ад'ювантну терапію при наявному високому ризику рецидиву у дорослих після видалення пухлини. Альтевір ® вводять внутрішньовенно в дозі 15 млн. МО/м 2 5 разів на тиждень протягом 4 тижнів, потім п/к у дозі 10 млн. МО/м 2 3 рази на тиждень протягом 48 тижнів. Дозу слід коригувати залежно від переносимості препарату.

Множинна мієлома: Альтевір ® призначають у період досягнення стійкої ремісії у дозі 3 млн. МО/м 2 3 рази на тиждень п/к.

Саркома Капоші на фоні СНІД:оптимальна доза не встановлена. Препарат можна застосовувати в дозах 10-12 млн. МО/м2/добу п/к або внутрішньом'язово. У разі стабілізації захворювання або відповіді на лікування, терапію продовжують доти, доки не відбудеться регрес пухлини або не буде потрібно відміна препарату.

Рак нирки:оптимальна доза та схема застосування не встановлені. Рекомендується застосовувати препарат підшкірно у дозах від 3 до 10 млн. МО/м 2 3 рази на тиждень.

Приготування розчину для внутрішньовенного введення

Набирають об'єм розчину Альтевіру, необхідний приготування необхідної дози, додають до 100 мл стерильного 0.9% розчину натрію хлориду і вводять протягом 20 хв.

Побічна дія

Загальні реакції:дуже часто - лихоманка, слабкість (є дозозалежними та оборотними реакціями, зникають протягом 72 годин після перерви в лікуванні або його припинення), озноб; менш часто – нездужання.

З боку центральної нервової системи:дуже часто – головний біль; менш часто - астенія, сонливість, запаморочення, дратівливість, безсоння, депресія, суїцидальні думки та спроби; рідко – нервозність, тривожність.

З боку кістково-м'язової системи:дуже часто – міалгія; менш часто – артралгія.

З боку травної системи:дуже часто – зниження апетиту, нудота; менш часто – блювання, діарея, сухість у роті, зміна смаку; рідко – біль у животі, диспепсія; можливе оборотне підвищення активності печінкових ферментів.

З боку серцево-судинної системи:часто – зниження АТ; рідко – тахікардія.

Дерматологічні реакції:менш часто – алопеція, підвищене потовиділення; рідко - шкірний висип, свербіж шкіри.

З боку системи кровотворення: можливі оборотні лейкопенія, гранулоцитопенія, зниження рівня гемоглобіну, тромбоцитопенія.

Інші:рідко – зниження маси тіла, аутоімунний тиреоїдит.

Протипоказання до застосування препарату

- тяжкі серцево-судинні захворювання в анамнезі (неконтрольована хронічна серцева недостатність, нещодавно перенесений інфаркт міокарда, виражені порушення серцевого ритму);

- тяжка ниркова та/або печінкова недостатність (в т.ч. викликана наявністю метастазів);

- епілепсія, а також тяжкі порушення функцій ЦНС, що особливо виражаються депресією, суїцидальними думками та спробами (в т.ч. в анамнезі);

- хронічний гепатит з декомпенсованим цирозом печінки та у хворих, які одержують або одержували нещодавно лікування імунодепресантами (за винятком завершеного короткочасного курсу лікування кортикостероїдами);

- аутоімунний гепатит або інше аутоімунне захворювання;

- Лікування імунодепресантами після трансплантації;

- Захворювання щитовидної залози, що не піддається контролю загальноприйнятими терапевтичними методами;

- Декомпенсовані захворювання легень (в т.ч. ХОЗЛ);

- Декомпенсований цукровий діабет;

- гіперкоагуляція (в т.ч. тромбофлебіт, тромбоемболія легеневої артерії);

- Виражена мієлодепресія;

- вагітність;

- Період лактації (грудного вигодовування);

- Підвищена чутливість до компонентів препарату.

Застосування препарату при вагітності та годуванні груддю

Препарат протипоказаний при вагітності та в період лактації (грудного вигодовування).

Застосування при порушеннях функції печінки

Застосування при порушеннях функції нирок

Препарат протипоказаний при тяжкій нирковій та/або печінковій недостатності (у т.ч. спричиненими наявністю метастазів).

особливі вказівки

До лікування Альтевіром хронічного вірусного гепатиту В та С рекомендується провести біопсію печінки, щоб оцінити ступінь пошкодження печінки (ознаки активного запального процесу та/або фіброзу). Ефективність лікування хронічного гепатиту С збільшується при комбінованій терапії Альтевіром та рибавірином. Застосування Альтевіру не є ефективним при розвитку декомпенсованого цирозу печінки або печінкової коми.

У разі виникнення побічних ефектів під час лікування Альтевіром дозу препарату слід зменшити на 50% або тимчасово відмінити препарат до їх зникнення. Якщо побічні ефекти зберігаються або виникають знову після зниження дози, або спостерігається прогрес захворювання, то лікування Альтевіром слід припинити.

При зниженні рівня тромбоцитів нижче 50x109/л або рівня гранулоцитів нижче 0.75x109/л рекомендується зменшення дози Альтевіру в 2 рази з контролем аналізу крові через 1 тиждень. Якщо ці зміни зберігаються, то препарат слід відмінити.

При зниженні рівня тромбоцитів нижче 25x109/л або рівня гранулоцитів нижче 0.5х109/л рекомендується відміна препарату Альтевір з контролем аналізу крові через 1 тиждень.

У пацієнтів, які отримують препарати інтерферону альфа-2b, у сироватці крові можуть визначатися антитіла, що нейтралізують його противірусну активність. Практично у всіх випадках титри антитіл невисокі, їхня поява не призводить до зниження ефективності лікування або виникнення інших аутоімунних порушень.

Передозування

Дані щодо передозування препарату Альтевір ® не надано.

Лікарська взаємодія

Лікарська взаємодія між Альтевіром та іншими лікарськими засобами не вивчена повністю. З обережністю слід застосовувати Альтевір ® одночасно зі снодійними та седативними засобами, наркотичними анальгетиками та препаратами, що потенційно мають мієлодепресивний ефект.

При одночасному призначенні Альтевіру та теофіліну слід контролювати концентрацію останнього у сироватці крові та за необхідності змінювати режим його дозування.

При застосуванні Альтевіру у комбінації з хіміотерапевтичними препаратами (цитарабін, циклофосфамід, доксорубіцин, теніпозид) збільшується ризик розвитку токсичних ефектів.

Умови відпустки з аптек

Препарат відпускається за рецептом.

Умови та термін зберігання

Препарат слід зберігати в недоступному для дітей місці відповідно до СП 3.3.2-1248-03 при температурі від 2° до 8°С; не заморожувати. Термін придатності – 18 місяців.

Транспортувати за температури від 2° до 8°С; не заморожувати.

Клінічна фармакологія
Фармакологічна дія - противірусна, протипухлинна та імуномодулююча.

Є високоочищеним рекомбінантним протеїном з молекулярною масою 19 300 дальтон. Отриманий із клону E.coli шляхом гібридизації плазміди бактерій з геном людських лейкоцитів, що кодує синтез інтерферону. На відміну від інтерферону альфа-2a має аргінін у положенні 23. Чинить противірусну дію, яка обумовлена взаємодією зі специфічними мембранними рецепторами та індукцією синтезу РНК і в кінцевому рахунку білків. Останні, у свою чергу, перешкоджають нормальній репродукції вірусу або його звільненню. Має імуномодулюючу активність, яка пов'язана з активацією фагоцитозу, стимуляцією утворення антитіл і лімфокінів. Чинить антипроліферативну дію на пухлинні клітини.
- Фармакокінетика
  При внутрішньом'язовому введенні 70% надходить у системний кровотік. Біотрансформується переважно у нирках та незначною мірою у печінці. Інтерферон альфа-2b виводиться із організму нирками.

Показання до застосування
- Хронічний гепатит В.
- Хронічний гепатит C.
- Грибоподібний мікоз.
- Первинна T-клітинна лімфосаркома.
- Волосато-клітинний лейкоз.
- Мієломна хвороба (генералізовані форми).
- Хронічний мієлолейкоз.
- Злоякісна меланома.
- Рак сечового міхура (поверхнево розташований).
- Базально-клітинна карцинома.
- Гострокінцевий кондиломатоз.
- Саркома Капоші (зокрема при СНІД).
- Неходжкінські лімфоми (у складі комбінованої терапії).

Спосіб застосування та дози
Індивідуальний, залежно від показань та схеми лікування.
- При волосато-клітинному лейкозі
  Дорослим в/м або п/к вводять по 2 млн.МЕ/м 2 3 рази на тиждень.
- При саркомі Капоші
  По 30 млн.МЕ/м 2 3рази на тиждень.

Протипоказання
- Тяжкі серцево-судинні захворювання.
- Тяжкі порушення функції печінки та/або нирок.
- Епілепсія та/або серйозні функціональні порушення ЦНС.
- Хронічний гепатит із загрозою розвитку цирозу печінки.
- Захворювання печінки у фазі декомпенсації.
- Хронічний гепатит на фоні або після попередньої терапії імунодепресантами (за винятком стану після відміни короткочасної терапії кортикостероїдами).
- Аутоімунний гепатит.
- Аутоімунні захворювання в анамнезі.
- Реципієнти трансплантату у стані імунодепресії.
- Попередні захворювання щитовидної залози.
- Підвищена чутливість до інтерферону альфа-2b.

Застосування при вагітності та в період годування груддю
Застосування при вагітності можливе у випадках, коли очікувана користь матері перевищує потенційний ризик для плода. Жінкам дітородного віку під час застосування інтерферону альфа-2b слід застосовувати надійні методи контрацепції.

При необхідності застосування під час лактації слід вирішити питання про припинення грудного вигодовування.

Взаємодія
Інтерферони можуть посилювати нейротоксичну, мієлотоксичну або кардіотоксичну дію препаратів, що призначалися раніше або одночасно з ними.

Особливі умови
Не слід застосовувати у пацієнтів із психічними розладами в анамнезі. З обережністю застосовують у пацієнтів із захворюваннями легень в анамнезі (в т.ч. при хронічній обструктивній хворобі легень), при цукровому діабеті з тенденцією до кетоацидозу, підвищеному зсіданні крові (в т.ч. при тромбофлебітах та тромбоемболіях легеневої артерії, в анамнезі) станах тяжкої мієлодепресії.

Перед початком та систематично в період лікування слід проводити контроль функції печінки, картини периферичної крові, біохімічних показників крові, креатиніну. У період лікування слід проводити адекватну гідратацію організму. У пацієнтів із хронічним гепатитом C під час лікування слід контролювати рівень тиреотропного гормону.

При хронічному гепатиті B, що супроводжується зниженням синтетичної функції печінки (що проявляється у зменшенні рівня альбуміну або збільшенні протромбінового часу), слід оцінити очікувану користь та можливий ризик терапії. Застосування при супутньому псоріазі виправдане у випадках, коли очікувана користь терапії перевищує потенційний ризик. При супутньому цукровому діабеті або артеріальній гіпертонії перед початком та у період лікування необхідний огляд очного дна. При вказівках в анамнезі на хронічну серцеву недостатність, інфаркт міокарда та/або попередні або наявні аритмії лікування інтерфероном альфа-2b слід проводити під суворим контролем лікаря.
- Вплив на здатність до керування автотранспортом та управління механізмами
  Вплив на здатність до керування автотранспортом та управління механізмами На початку терапії слід утримуватися від потенційно небезпечних видів діяльності, що вимагають підвищеної уваги, швидких психомоторних реакцій, аж до періоду стабілізації дії інтерферону альфа-2b.
Інтерферон альфа-2b у формі порошку для ін'єкцій та розчину для ін'єкцій включено до Переліку ЖНВЛЗ.

В/м, п/к, в/в, внутрішньоміхурово, внутрішньочеревно, у вогнище та під вогнище ураження. Хворим із числом тромбоцитів менше 50 тис./мкл вводять п/к.
Лікування має бути розпочато лікарем. Далі з дозволу лікаря підтримуючу дозу хворий може вводити собі самостійно (якщо препарат призначений підшкірно).
Хронічний гепатит В: дорослим - по 5 млн. МО щодня або по 10 млн. МО 3 рази на тиждень через день, протягом 4-6 місяців (16-24 тижнів).
Дітям - п/к у початковій дозі 3 млн МО/кв.м 3 рази на тиждень (через день) протягом 1 тижня лікування з подальшим збільшенням дози до 6 млн МО/кв. ) 3 рази на тиждень (через день).
Тривалість лікування – 4-6 міс (16-24 тижнів).
За відсутності поліпшення за вмістом сироваткового ДНК вірусу гепатиту В після лікування протягом 3-4 місяців у максимальній переносимій дозі препарат слід відмінити.
Рекомендації щодо корекції дози у разі зменшення числа лейкоцитів, гранулоцитів або тромбоцитів: при зниженні числа лейкоцитів менше 1.5 тис./мкл, тромбоцитів менше 100 тис./мкл, гранулоцитів менше 1 тис./мкл – дозу знижують на 50%, у разі зниження числа лейкоцитів менше 1200/мкл, тромбоцитів менше 70 тис./мкл, гранулоцитів менше 750/мкл – лікування припиняють та призначають знову у колишній дозі після нормалізації цих показників.
Хронічний гепатит С - по 3 млн МО через день (як монотерапія або в комбінації з рибавірином). У хворих з рецидивуючим перебігом захворювання застосовується у комбінації з рибавірином. Рекомендована тривалість лікування обмежується 6 міс.
У хворих, які раніше не отримували лікування інтерфероном альфа2b, ефективність лікування збільшується при використанні комбінованої терапії з рибавірином. Тривалість комбінованої терапії щонайменше 6 міс. Терапію слід проводити 12 місяців хворим з I генотипом вірусу і високим вірусним навантаженням, у яких до кінця перших 6 місяців лікування РНК вірусу гепатиту C в сироватці крові не визначається. При прийнятті рішення про продовження комбінованої терапії до 12 місяців слід, також, брати до уваги ін. негативні прогностичні фактори (вік старше 40 років, чоловіча стать, наявність фіброзу).
Як монотерапія Інтрон А застосовується в основному при непереносимості рибавірину або за наявності протипоказань до його застосування. Оптимальна тривалість монотерапії Інтроном А ще не встановлена; В даний час рекомендується проводити лікування від 12 до 18 місяців. Протягом перших 3-4 місяців лікування зазвичай визначають наявність РНК вірусу гепатиту C, після чого лікування продовжують тільки тим хворим, у яких РНК вірусу гепатиту C не виявлено.
Хронічний гепатит D: п/к у початковій дозі 5 млн МО/кв.м 3 рази на тиждень протягом принаймні 3-4 місяців, хоча може бути показана триваліша терапія. Дозу підбирають з урахуванням переносимості препарату.
Папіломатоз гортані: по 3 млн МО/кв.м п/к 3 рази на тиждень (через день). Лікування починають після хірургічного (лазерного) видалення пухлинної тканини. Дозу підбирають з урахуванням переносимості препарату. Досягнення позитивної відповіді може вимагати лікування протягом більше 6 міс.
Волосатоклітинний лейкоз: 2 млн МО/кв.м п/к 3 рази на тиждень (через день). Дозу підбирають з урахуванням переносимості препарату.
Пацієнти після спленектомії і без спленектомії однаково відповідали на лікування і відзначали подібне зниження потреби в трансфузіях. Нормалізація одного або кількох показників крові зазвичай починається протягом 1-2 місяців після початку лікування. Для покращення всіх 3 показників крові (числа гранулоцитів, тромбоцитів та рівня Hb) може знадобитися 6 місяців або більше. До початку лікування необхідно визначити рівень Hb і число тромбоцитів, гранулоцитів і волохатих клітин у периферичній крові та число волохатих клітин у кістковому мозку. Ці параметри слід періодично контролювати під час лікування з метою оцінки відповіді. Якщо хворий відповідає на терапію, то її слід продовжувати доти, доки не припиниться подальше поліпшення, а лабораторні показники не будуть стабільними протягом 3 місяців. Якщо протягом 6 місяців хворий не відповідає на терапію, лікування слід припинити. Терапію не слід продовжувати у разі швидкого прогресування хвороби та тяжких небажаних явищ.
У разі перерви в лікуванні Інтроном А повторне застосування було ефективним більш ніж у 90% хворих.
Хронічний мієлолейкоз. Рекомендована доза як монотерапія - 4-5 млн МО/кв.м на день щодня, п/к. Для підтримки кількості лейкоцитів може бути потрібне застосування в дозі - 0.5-10 млн МО/кв.м. Якщо лікування дозволяє досягти контролю кількості лейкоцитів, то для підтримки гематологічної ремісії препарат слід застосовувати в максимальній дозі, що переноситься (4-10 млн МО/кв.м щодня). Препарат необхідно відмінити через 8-12 тижнів, якщо терапія не призвела, принаймні, до часткової гематологічної ремісії або клінічно значимого зниження кількості лейкоцитів.
Комбінована терапія з цитарабіном: Інтрон А - 5 млн МО/кв.м щодня підшкірно, а через 2 тижні додають цитарабін у дозі 20 мг/кв.м щодня підшкірно, протягом 10 днів поспіль щомісяця (максимальна доза - до 40 мг/добу). Інтрон А слід відмінити через 8-12 тижнів, якщо терапія не призвела, принаймні, до часткової гематологічної ремісії або клінічно значимого зниження кількості лейкоцитів.
Дослідження продемонстрували велику ймовірність досягнення відповіді на терапію Інтроном А у хворих із хронічною фазою хвороби. Лікування слід розпочинати якомога раніше після встановлення діагнозу і продовжувати до повної гематологічної ремісії або протягом принаймні 18 місяців. У хворих, які відповідають лікування, поліпшення гематологічних показників зазвичай спостерігається протягом 2-3 міс. У таких пацієнтів лікування слід продовжувати до повної гематологічної ремісії, критерієм якої є кількість лейкоцитів у крові 3-4 тис./мкл. У всіх хворих на повний гематологічний ефект лікування слід продовжувати з метою досягнення цитогенетичного ефекту, який у деяких випадках розвивається лише через 2 роки після початку терапії.
У хворих з числом лейкоцитів більше 50 тис./мкл на момент встановлення діагнозу лікар може почати лікування з гідроксимочевини у стандартній дозі, а потім, коли кількість лейкоцитів знизиться менше 50 тис./мкл, замінити її на Інтрон А. У хворих із нововиявленою хронічною фазою Ph-позитивного хронічного мієлолейкозу проводилася також комбінована терапія Інтроном А та гідроксимочевиною. Лікування Інтроном А починали з доз 6-10 млн МО/добу п/к, потім додавали гідроксимочевину в дозі 1-1.5 г 2 рази на добу, якщо вихідне число лейкоцитів перевищувало 10 тис./мкл, і продовжували її застосування доти, поки число лейкоцитів не знижувалося менше ніж 10 тис./мкл. Потім гідроксимочевину скасовували, а дозу Інтрона А підбирали т.ч., щоб число нейтрофілів (паличкоядерних та сегментоядерних лейкоцитів) становило 1-5 тис./мкл, а число тромбоцитів понад 75 тис./мкл.
Тромбоцитоз, асоційований із хронічним мієлолейкозом: 4-5 млн МО/кв.м на день, щодня, п/к. Для підтримки кількості тромбоцитів може знадобитися застосування препарату в дозах 0.5-10 млн. МО/кв.м.
Неходжкінська лімфома: п/к - 5 млн МО 3 рази на тиждень (через день) у поєднанні з хіміотерапією.
Саркома Капоші на фоні СНІДу: оптимальної дози не встановлено. Є дані про ефективність Інтрона А в дозі 30 млн МО/кв.м 3-5 разів на тиждень. Препарат також застосовували у менших дозах (10-12 млн МО/кв.м/добу) без явного зниження ефективності.
У разі стабілізації захворювання або відповіді на лікування, терапію продовжують доти, доки не відбудеться регрес пухлини або не буде потрібно відміна препарату (розвиток тяжкої опортуністичної інфекції або небажаного побічного явища). У клінічних дослідженнях хворі зі СНІДом та саркомою Капоші отримували Інтрон А у поєднанні з зидовудином за наступною схемою: Інтрон А – у дозі 5-10 млн МО/кв.м, зидовудин – 100 мг кожні 4 год. Основним токсичним ефектом, що обмежував дозу, була нейтропенія. Лікування Інтроном А можна розпочати

Винахід відноситься до генної інженерії, біотехнології, медицини, фармакології. Нова рекомбінантна мультикопійна плазмідна ДНК pSX50, що кодує синтез лейкоцитарного альфа-2b інтерферону людини, експресія якого знаходиться під контролем лактозного та триптофанового промоторів та термінатора транскрипції. В результаті трансформації клітин реципієнтного штаму Е. coli BL21 рекомбінантної плазмідної ДНК pSX50 отримано штам Е. coli SX50 - продуцент рекомбінантного лейкоцитарного альфа-2b інтерферону людини з продуктивністю до 0.9-1.0 г альфа-2b. Спосіб отримання рекомбінантного альфа-2b інтерферону заснований на використанні створеного рекомбінантного штаму Е. coli SX50 і що передбачає його глибинне культивування на живильному середовищі з пониженим вмістом триптофану при безперервному додаванні живильних субстратів в процесі біосинтезу, механічне концентрованому розчині гуанідин гідрохлориду з подальшою ренатурацією інтерферону у фізіологічних буферних розчинах у присутності хаотропних агентів та його очищенням з використанням тристадійного хроматографічного очищення інтерферону на смолах типу Chelating Sepharose Fast Flow іммобілізованою іон ах типу СМ Sephsrose Fast Flow та гель фільтраційної хроматографії на смолах типу Superdex 75. Спосіб дозволяє отримувати субстанцію інтерферону більше 99% чистоти за даними електрофорезу в редукаційних і нередукуючих умовах при фарбуванні гелів сріблом і більше 98% за даними RF HPLC і не містить пірогенів (LAL-тест) 400-800 мг з 1 л культурального середовища. 3 зв. та 3 з.п ф-ли, 6 іл.

Малюнки до патенту РФ 2242516

Винахід відноситься до генно-інженерних лікарських препаратів, одержуваних біотехнологічним шляхом, а саме до способів промислового отримання рекомбінантного лейкоцитарного інтерферону альфа-2b людини медичного призначення (далі інтерферон), а також до рекомбінантних штамів продуцентів Escherichia coli (Echerichia coli). що кодує синтез інтерферону.

Інтерферони являють собою білкові молекули з молекулярною масою від 15000 до 21000 дальтон, що продукуються та секретуються клітинами у відповідь на вірусну інфекцію або інші збудники. Виділяють три основні групи інтерферонів: альфа, бета та гама. Самі собою ці групи є однорідними і можуть містити кілька різних молекулярних різновидів інтерферону. Так, виділено понад 14 генетичних різновидів інтерферону альфа, які становлять інтерес і знаходять широке застосування в медицині як противірусні, антипроліферативні та імуномодулюючі засоби.

Відомі способи одержання лейкоцитарного інтерферону людини з лейкоцитів донорської крові людини, індукованих вірусами та іншими індукторами (SU1713591, RU 2066188 , RU 2080873).

Основним недоліком цих способів отримання інтерферонів є ймовірність контамінації кінцевого продукту вірусами людини, такими як вірус гепатитів і С, вірусу імунодефіциту та ін.

В даний час більш перспективним визнаний спосіб отримання інтерферону мікробіологічним синтезом, який забезпечує можливість отримання цільового продукту з більш високим виходом з порівняно недорогої вихідної сировини. Підходи, що використовуються при цьому, дозволяють створити оптимальні для бактеріальної експресії варіанти структурного гена, а також регуляторних елементів, що контролюють його експресію.

Як вихідні мікроорганізми використовують різні конструкції штамів Pichia pastoris, Pseudomonas putida і Escherichia coli.

Недоліком використання P. pastoris як продуцента інтерферону (J.N. Garcia, J.A. Aguiar et al. //High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12(3),152-155, 1995), є вкрай складні умови ферментації цього дріжджів, необхідність суворо підтримувати концентрацію індуктора, зокрема метанолу, у процесі біосинтезу. Недоліком використання штамів Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) є складність процесу ферментації при низькому рівні експресії (10 мг інтерферону на 1 л культурального середовища). Більш продуктивним є використання штамів Escherichia coli (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9): S9-41-S9-51).

Відома велика кількість плазмід і створених на їх основі штамів Е. coli, що експресують інтерферон: штами Е. coli ATCC 31633 та 31644 з плазмідами Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 або Z-pBR 322(Pstl) -AHL6 (SU 1764515), штам Е. coli pINF-AP2 (SU 1312961), штам Е. coli pINF-F-Pa (AU 1312962), штам E.Coli SG 20050 з плазмід p280/2 та ін. Біоорганічна хімія, 1987, т.13, №9, с.1186-1193), штам E.Coli SG 20050 з плазмідою pINF14 (SU 1703691), штам E.coli SG 20050 з плазмід RU 2054041) та ін. Недоліком технологій, заснованих на використанні цих штамів, є їхня нестабільність, а також недостатній рівень експресії інтерферону.

Поряд з особливостями використовуваних штамів ефективність процесу багато в чому залежить від технології виділення та очищення інтерферону.

Відомий спосіб отримання інтерферону, що включає культивування клітин Ps. putida, руйнування біомаси, обробку поліетиленіміном, фракціонування сірчанокислим амонієм, гідрофобну хроматографію на фенілсилохромі С-80, рН-фракціонування лізату, його концентрування та діафільтрацію, іонообмінну хроматографію на целюлозе елюентів на целюлозі СМ -52, концентрування пропусканням через касету фільтрів та гель-фільтрацію на Сефадекс G-100 (SU 1640996). Недоліком цього способу, крім складної багатостадійної ферментації, є багатостадійність при отриманні кінцевого продукту.

Відомий також спосіб отримання інтерферону, що включає культивування штаму E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульйоні в колбах в термостатированном шейкері, центрифугування біомаси, її промивання буферним розчином і обробку ультразвуком для руйнування клітин. Отриманий лізат центрифугують, промивають 3М розчином сечовини в буфері, розчиняють у розчині гуанідин хлориду в буфері, обробляють ультразвуком, центрифугують, проводять окислювальний сульфітоліз, діаліз проти 8 М сечовини, ренатурацію і остаточну двостадію ( RU 2054041). Недоліками цього є його відносно невисока продуктивність основних етапів процесу виділення і очищення. Особливо це стосується ультразвукової обробки продукту, діалізу та окислювального сульфітолізу, що призводить до нестабільності виходу інтерферону, а також до неможливості використання цього методу для промислового виробництва інтерферону.

В якості найближчого аналога (прототипу) може бути вказаний спосіб отримання лейкоцитарного інтерферону людини, що полягає в культивуванні рекомбінантного штаму E.coli, заморожуванні отриманої біомаси при температурі не вище -70°С, розморожуванні, руйнуванні клітин мікроорганізму лізоцимом, видалення у лізат ДНК-ази та очищенням виділеної нерозчинної форми інтерферону відмиванням буферним розчином з детергентами, розчиненні осаду інтерферону в розчині гуанідин гідрохлориду, ренатурації та одностадійному очищенні іонообмінною хроматографією. Як продуцент використовують штам E.coli SS5, отриманий за допомогою рекомбінантної плазміди pSS5, що містить три промотори: P lac , P t7 і P trp , і ген альфа-інтерферону з введеними нуклеотидними замінами.

Експресія інтерферону штамом E.coli SS5, що містить цю плазміду, контролюється трьома промоторами: P lac , P t7 і P trp . Рівень експресії інтерферону становить близько 800 мг на 1 л клітинної суспензії ( RU 2165455).

Недоліком способу є низька технологічність використання ферментативного руйнування клітин, ДНК та РНК мікроорганізму та одностадійне хроматографічне очищення інтерферону. Це зумовлює нестабільність процесу виділення інтерферону, призводить до зниження його якості та обмежує можливість використання наведеної схеми для промислового виробництва інтерферону. Недоліками даної плазміди та штаму на її основі є використання в плазміді сильного нерегульованого промотора фага Т7 у штамі Е. coli BL21 (DE3), в якому ген Т7 РНК полімерази знаходиться під промотором lac оперону і який завжди "тече". Отже, у клітині безперервно відбувається синтез інтерферону, що призводить до дисоціації плазміди та зниження життєздатності клітин штаму, і в результаті – зниження виходу інтерферону.

Завданням даного винаходу є конструювання рекомбінантного промислового штаму продуцента Е. coli за допомогою нової рекомбінантної плазмідної ДНК, що володіє високим рівнем біосинтезу інтерферону, і розробка ефективної промислової технології отримання субстанції інтерферону медичного призначення, відповідної за якістю "European-European"

Зазначене завдання вирішувалося створенням рекомбінантної плазмідної ДНК pSX50 та штаму Escherichia coli SX50, депонованого у Всеросійській колекції промислових штамів ФГУП ДержНДІ генетики, номер ВКПМ В-8550,

а також способом отримання рекомбінантного альфа-2b інтерферону, заснованим на використанні рекомбінантного штаму Е. coli SX50 і що передбачає його глибинне культивування на живильному середовищі зі зниженим вмістом триптофану при безперервному додаванні живильних субстратів у процесі біосинтезу, механічне білка в концентрованому розчині гуанідин гідрохлориду з подальшою ренатурацією інтерферону у фізіологічних буферних розчинах у присутності хаотропних агентів і тристадійним хроматографічним очищенням інтерферону на смолах типу Chelating Sepharose Fast Flow, іммобілізованою іонами типу CM Sepharose Fast Flow і фільтраційний гель хроматографії на смолах типу Superdex 75

Згідно винаходу пропонується нова рекомбінантна мультикопійна плазмідна ДНК pSX50, що кодує синтез лейкоцитарного альфа-2b інтерферону людини, експресія якого знаходиться під контролем лактозного та триптофанового промоторів та термінатора транскрипції. Плазміда pSX50 має 3218 пар основ (п.о.) та характеризується наявністю наступних фрагментів:

Послідовність з 1 нуклеотиду по 176 нуклеотид (н.) включає фрагмент ДНК розміром 176 п.о., що містить триптофановий промотор (P trp);

Послідовність із 177 н. за 194 н. містить синтетичний фрагмент ДНК розміром 18 п.о., що містить послідовність Шайн Дельгарно, відповідальний за ініціацію трансляції;

Послідовність із 195 н. за 695 н. містить фрагмент ДНК розміром 501 в. , у положенні 67 заміна А на С, у положенні 69 заміна G на Т, у положенні 70 заміна А на С, у положенні 72 заміна А на Т, у положенні 96 заміна G на А, у положенні 100 заміна А на С, положенні 102 заміна А на Т, у положенні 114 заміна А на С, у положенні 120 заміна С на G, у положенні 126 заміна G на А, у положенні 129 заміна G на А, у положенні 330 заміна С на G, у положенні 339 заміна G на А, у положенні 342 заміна G на А, у положенні 487 заміна А на С, у положенні 489 заміна А на Т, у положенні 495 заміна G на А;

Послідовність із 696 н. за 713 н. включає синтетичний фрагмент ДНК розміром 18 п.о., що містить синтетичний полілінкер;

Послідовність із 714 н. до 1138 н. включає фрагмент ДНК плазміди рКК223-3 з 4129 н. за 4553 н. розміром 425 п.о., що містить послідовність суворого термінатора транскрипції rrnBT 1 T 2 ;

Послідовність із 1139 н. до 1229 н. включає фрагмент ДНК плазміди pUC19 з 2487 н. до 2577 н. розміром 91 п.о., що містить промотор гена -лактомази (ген стійкості до ампіциліну - Аmр R);

Послідовність із 1230 н. до 2045 н. містить фрагмент ДНК плазміди pUC4K з 720 н. до 1535 н. розміром 816 п.о., що містить структурну ділянку гена kan;

Послідовність із 2046 н. за 3218 зв. включає фрагмент ДНК плазміди pUC19 з 1625 по 453 н. розміром 1173 п.н., що містить послідовність, відповідальну за реплікацію плазміди (ori) і промотора lac (P lac).

На фіг.1-5 зображені схеми конструювання та фізична карта плазміди рSХ50.

На фіг.6 представлена встановлена для плазміди pSX50 повна послідовність нуклеотидів.

Штам Escherichia coli SX50 отримано трансформацією клітин Escherichia coli BL21 плазмідою pSX50 з використанням традиційної генно-інженерної технології. Штам E.Coli SX50 характеризується такими ознаками.

Культурально-морфологічні ознаки

Клітини дрібні, прямі, потовщеної паличкоподібної форми, грамнегативні, неспороносні. Клітини добре ростуть на простих живильних середовищах. При зростанні на агарі "Діфко" утворюються круглі, гладкі, опуклі, каламутні, блискучі, сірі колонії, з рівними краями. При зростанні рідких середовищах (у мінімальному середовищі з глюкозою або в LB-бульйоні) утворюють інтенсивну рівну каламут.

Фізико-біологічні ознаки

Аероб. Температурний діапазон зростання 4-42°З оптимумі рН 6,5-7,5.

Як джерело азоту використовують як мінеральні солі в амонійній та нітратній формах, так і органічні сполуки у вигляді амінокислот, пептону, триптону, дріжджового екстракту і т.д.

Як джерело вуглецю використовують амінокислоти, гліцерин, вуглеводи. Стійкість до антибіотиків. Клітини виявляють стійкість до канаміцину (до 100 мкг/мл).

Штам Escherichia coli 8Х50 – продуцент інтерферону.

Спосіб, умови та склад середовища для зберігання штаму

L-arape з додаванням канаміцину до концентрації 20 мкг/мл під маслом, L-бульйоні, що містить 15% гліцерину і відповідними антибіотиками в ампулах при температурі мінус 70°С, в ліофілізованому стані в ампулах при температурі плюс 4°.

Штам Escherichia coli SX50 ідентифікований за Визначником Берги (1974) як штам виду Escherichia coli.

Спосіб промислового отримання альфа-2b інтерферону

Особливістю заявляється способу є розробка технології, що дозволяє виділяти інтерферон з нерозчинної форми, що накопичується протягом ферментації, що дозволяє суттєво спростити технологічну схему процесу виділення та підвищити вихід цільового продукту.

Спосіб полягає в культивуванні штаму Escherichia coli SХ50 в живильному середовищі, з постійним додаванням поживних субстратів, переважно глюкози і дріжджового екстракту, в процесі біосинтезу, переважно зі зниженим вмістом триптофану, механічному руйнуванні клітин мікрофером0 високо0 розчині гуанідин гідрохлориду, ренатурації інтерферону у фізіологічних буферних розчинах у присутності хаотропних агентів, з подальшим тристадійним хроматографічним очищенням інтерферону на смолах типу Chelating Sepharose Fast Flow, іммобілізованих іонами Сu +2 , ose Fast Flow та гель фільтраційну хроматографію на смолах типу Superdex 75

Оптимальними умовами проведення окремих стадій отримання інтерферону є:

Ферментацію проводять при безперервному додаванні субстратів протягом усього процесу, що зумовлює високий рівень експресії інтерферону;

Руйнування клітин здійснюють у дезінтеграторі типу Гаулін при тиску 900 bar;

Видалення розчинних клітинних компонентів (ДНК, РНК, білків, ліпополісахаридів і т.д.) проводять промиванням нерозчинної форми інтерферону буферними розчинами, що містять детергенти (Тритон XI00, сечовина і т.д.);

Осад, що містить інтерферон, розчиняють у буферному розчині 6 М гуанідину гідрохлориду;

Ренатурацію інтерферону проводять у фізіологічному буферному розчині, що містить хаотропні агенти;

Тристадійне хроматографічне очищення інтерферону проводять на Chelating Sepharose Fast Flow, іммобілізованої іонами Сu +2 , на катіонообмінної смолі СМ Sepharose Fast Flow і фільтраційну гель хроматографію на смолі типу Superdex 75;

Після кожного хроматографічного очищення проводять стерилізуючу фільтрацію через апірогенні фільтри з розмірами пор 0.22 мкм.

Вихід інтерферону внаслідок застосування описаного способу становить приблизно 400-800 мг інтерферону з 1 л культурального середовища. Якість продукту відповідає нормам та вимогам "European Pharmacopoeia" для субстанції альфа-2b інтерферону.

Істотними відмінностями заявляється способу від прототипу є:

Використання конструкції штаму з більш високою продуктивністю, що дозволяє отримувати при біосинтезі більшу кількість інтерферону з 1 л культурального середовища;

Використання ефективного механічного руйнування клітинної біомаси, що дозволяє отримувати чистіший екстракт нерозчинної форми інтерферону за більш короткий час, з меншими втратами;

Використання буферних фізіологічних розчинів при ренатурації в присутності хаотропних агентів дозволяє підвищити вихід коректно ренатурованої форми інтерферону;

Тристадійне хроматографічне очищення інтерферону дозволяє отримувати субстанцію інтерферону більше 99% чистоти за даними електрофорезу в редулюючих і нередукуючих умовах при фарбуванні гелів сріблом і більше 98% за даними RF HPLC і практично не містить пірогенів (LAL-тест).

Сутність та переваги заявляється групи винаходів ілюструється наступними прикладами.

Приклад 1. Конструювання рекомбінантної плазміди рSХ50

Спосіб конструювання плазміди pSX50 включає наступні етапи:

Конструювання векторної плазміди pSX10;

1. конструювання плазміди pSX3 (2641 п.о.)

2. конструювання векторної плазміди pSX10 (2553 п.о.)

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX41 (3218 п.о.);

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX43 (3218 п.о.);

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX45 (3218 п.о.);

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX50 (3218 п.о.).

Конструювання векторної плазміди pSX10

Векторна плазміда pSX10 являє собою вектор pUC19, в якому кодуюча послідовність гена бета-лактомази, що забезпечує стійкість до ампіциліну, замінюється послідовністю кодування гена kаn і містить термінатор транскрипції з плазміди рКК223-3.

Конструювання векторної плазміди pSS10 проводять у дві стадії:

Отримання плазміди pSX3 (2641 п.о.), що представляє собою плазміду pUC19, в якій кодує область гена аmp гена замінюється на кодуючу область гена kan;

Отримання вітерної плазміди pSX10 (2553 п.о.), що являє собою плазміду pSX3, в якій за сайтом BamHI вставлений фрагмент ДНК, що кодує термінатор транскрипції рГBT 1 T 2 .

Для отримання плазміди pSX3 проводять п'ять раундів ампліфікації ДНК методом ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція). В ході першого раунду, використовуючи ДНК плазміди pUC19 як матрицю, проводять ампліфікацію фрагмента ДНК розміром 1828 п.о. (фрагмент PU1-PU2) за допомогою праймерів:

Дану та наступні ПЛР реакції проводять у наступних умовах: 20 mМ Tis-HCl, рН 8.8, 10 mM (NH 4) 2 SO 4 ,10 mМ КСl, 2 тМ MgCl 2 , 0.1% Triton Х100,0.1 mg/ml BSA, 1 mM кожного dNTP, 1.25 од. Pfu ДНК полімерази, 100 нг ДНК. Процес ампліфікації складається з наступних стадій: прогрівання при 95°С 5 хв, 35 циклів ПЛР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 2 хв 72°С) та інкубація 10 хв при 72°С. Після ампліфікації (і після наступних ампліфікацій) фрагмент ДНК очищають електрофоретично 1% агарозному гелі. В ході другого та третього раундів, використовуючи ДНК плазміди pUC4K як матрицю, проводять ампліфікацію фрагмента ДНК розміром 555 п.о. (Фрагмент КМ1-КМ2) за допомогою праймерів:

та ампліфікацію фрагмента ДНК розміром 258 п.о. (КМЗ-КМ4) із праймерів

У п'ятому раунді ПЛР проводять об'єднання фрагментів (PU1-PU2) і (КМ1-КМ4) у таких умовах: прогрівання при 95°С 5 хв, 5 циклів ПЛР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 хв 72° С) та інкубація 10 хв при 72°С. ДНК, отриману після останньої ПЛР, прямо трансформують у клітини штаму E.coli DH5 і висівають на середовище LA, що містить 20 мкг/мл канаміцину. Після інкубування протягом 12 годин при 37°С клони відсівають, виділяють плазмідну ДНК та проводять рестрикційний аналіз. В результаті одержують плазміду рSХ3 розміром 2641 п.о.

Для отримання векторної плазміди pSX10 проводять три раунди ампліфікації ДНК методом ПЛР. В ході першого раунду, використовуючи ДНК плазміди pSX3 як матрицю, проводять ампліфікацію фрагмента ДНК розміром 2025 п.о. (фрагмент 10.1-10.2) за допомогою праймерів:

У ході другого раунду, використовуючи ДНК плазміди рКК223-3 як матрицю, проводять ампліфікацію фрагмента ДНК розміром 528 п.о. (фрагмент КК1-КК2) за допомогою праймерів:

У третьому раунді ПЛР проводять об'єднання фрагментів (10.1-10.2) і (КК1-КК2) у таких умовах: прогрівання при 95°С 5 хв, 5 циклів ПЛР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 хв 72° С) та інкубація 10 хв при 72°С. ДНК, отриману після останньої ПЛР, прямо трансформують у клітини штаму E.coli DH5 і висівають на середовище LA, що містить 20 мкг/мл канаміцину. Після інкубування протягом 12 годин при 37°С клони відсівають, виділяють плазмідну ДНК та проводять рестрикційний аналіз. В результаті одержують плазміду pSX10 розміром 2553 п.о.

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX41

Рекомбінантна плазміда pSX41 являє собою Hind III - BamHI фрагмент ДНК векторної плазміди pSX3 (2529 п.о.), Hind III - EcoRI фрагмент ДНК розміром 168 п.о. синтетичний фрагмент ДНК розміром 20 п.о., що кодує SD послідовність (Шайн-Дельгарно) та XbaI-BamHI фрагмент ДНК розміром 501 п.о., що кодує ген альфа 2b інтеферону людини.

Для отримання Hind III - ВаmHI фрагмент ДНК векторної плазміди pSX3 (2529 п.о.) ДНК плазміди pSX3 обробляють ферментами рестрикції HindIII і BamHI з подальшим електрофоретичним очищенням в 1% агарозному гелі. Hind III EcoRI фрагмент ДНК розміром 168 в.

Для отримання EcoRI-Xbal синтетичний фрагмент ДНК розміром 20 п.о., що кодує послідовність SD (Шайн-Дельгарно), синтезуються наступні комплементарні олігонуклеотиди:

XbaI-ВаmIII фрагмент ДНК розміром 501 п.о., що кодує ген альфа 2b інтеферону людини, отримують методом ПЛР, використовуючи тотальну ДНК людини як матрицю і праймери IFN1 і IFN2 з подальшою обробкою ампліфікованого фрагмента рестриктазами Xbal і

Далі електрофоретично очищені фрагменти об'єднують, лігують ферментом лігаза фага Т4, ДНК трансформують у клітини штаму E.coli DH5 і висівають на середовище LA, що містить 20 мкг/мл канаміцину. Після інкубування протягом 12 годин при 37°С клони відсівають, виділяють плазмідну ДНК, проводять рестрикційний аналіз та визначають первинну структуру ДНК. В результаті одержують плазміду pSX41 розміром 3218 п.о. Далі проводять поетапний мутагенез гена інтерферону збільшення рівня експресії цільового продукту. Мутагенез гена інтерферону полягає в заміні рідко зустрічаються в Е. coli триплетів, що кодують відповідні амінокислоти на часто зустрічаються в Е. coli триплети, що кодують ці ж амінокислоти. Мутагенез ДНК гена інтерферону проводять методом ПЛР.

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX43

Для отримання рекомбінантної плазміди pSX43 проводять один раунд ампліфікації ДНК методом ПЛР, використовуючи ДНК плазміди pSX41 як матриці та праймери IFN3 та IFN4:

ПЛР проводять у наступних умовах: прогрівання при 95°С 5 хв, 20 циклів ПЛР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 хв 72°С) та інкубація 20 хв при 72°С. ДНК, отриману після ПЛР, прямо трансформують у клітини штаму E.coli DH5 і висівають на середовище LA, що містить 20 мкг/мл канаміцину. Після інкубування протягом 12 годин при 37°С клони відсівають, виділяють плазмідну ДНК, проводять рестрикційний аналіз та визначають первинну структуру ДНК. В результаті одержують плазміду рSХ43 розміром 3218 п.о.

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX45

Для отримання рекомбінантної плазміди pSX45 проводять один раунд ампліфікації ДНК методом ПЛР, використовуючи ДНК плазміди pSX43 як матриці та праймери IFN5 та IFN6:

Конструювання рекомбінантної плазміди pSX50

Для отримання рекомбінантної плазміди pSX50 проводять один раунд ампліфікації ДНК методом ПЛР, використовуючи ДНК плазміди pSX45 як матриці та праймери IFN7 та IFN8:

Приклад 2. Отримання штаму Е. coli SX50 – продуцента інтерферону

Штам продуцент інтерферону Е. coli SX50 одержують шляхом трансформації клітин штаму Е. coli BL21 рекомбінантною плазмідою рSХ50. Штам продуцент інтерферону вирощують в 30 л ферментер до оптичної щільності 25.0-30.0 о.е. серед М9, що містить 1% кислотного гідролізату казеїну (Difco), 1% глюкози, 40 мкг/мл канаміцину, при температурі 38-39°С. У процесі ферментації проводять безперервне додавання поживного субстрату, використовуючи гравітометричний контролер.

Приклад 3. Спосіб виділення інтерферону із штаму Е. coli SX50

Отримання інтерферону проводили у 4 етапи:

1 етап. Культивування штаму Е. coli SX50.

2 етап. Виділення та очищення нерозчинної форми інтерферону.

3 етап. Розчинення та ренатурація інтерферону.

4 етап. Хроматографічна очистка інтерферону.

1 етап. Культивування штаму Е. coli SX50

Вирощений посівний матеріал штаму Е. coli SX50 в об'ємі 3 л багатого середовища LB протягом 12 год при 26°С асептично вносять в ферментер, що містить 27 л стерильного середовища, що містить М9, 1% кислотного гідролізату казеїну, 1% глюкози 2 , 0.1 mM CaCl 2 , 40 мг/мл канаміцину. Культивування в ферментері проводять при температурі 38-39°С, підтримуючи рН 7±0,15 шляхом автоматичного підтитрування 40% розчином гідроксиду натрію. Концентрацію розчиненого кисню в діапазоні (50±10)% від насичення підтримують шляхом зміни швидкості обертання мішалки від 100 до 800 об/хв і подачі повітря від 1 до 15 л/хв. Концентрацію субстратів, зокрема глюкози та дріжджового екстракту, вимірюють протягом ферментації та підтримують їх концентрацію шляхом зміни швидкості подачі концентрованих розчинів через перистальтичні насоси, використовуючи гравіметричний контролер.

Накопичення інтерферону у вигляді нерозчинної форми контролюють за допомогою фазово-контрастної мікроскопії, методом електрофорезу у 15% поліакриламідному гелі (SDS-PAAG) та методом зворотнофазної високоефективної хроматографії (RF HPLC). Ферментацію зупиняють після досягнення максимальної оптичної щільності (~ 25-30 о.е.) та зупинки синтезу інтерферону. Після закінчення ферментації культуральну рідину сепарують центрифугуванням у проточному роторі при швидкості обертання 5000-10000 об/хв. Біомасу фасують поліетиленові пакети і заморожують при температурі мінус 70°С.

2 етап. Виділення та очищення нерозчинної форми інтерферону

300-400 г замороженої біомаси штаму Е. coli SX50 суспедують у 3000 мл буфера 1 (20 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 10 мМ ЕДТА, 0,1% Triton X100). Суспензію пропускають через проточний гомогенізатор типу Гаулін, підтримують тиск 900 бар та центрифугують у проточному роторі при 15 000 об/хв. Отриманий осад промивають в аналогічних умовах послідовно буферами 2 (20 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 1 мМ ЕДТА, 3 М сечовини) і буфером 3 (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 1 мМ ЕДТА) і остаточно осад інтерферону суспедують мл буфера 3. При цьому час виділення та очищення нерозчинної форми інтерферону становить не більше 5 год.

3 етап. Розчинення та ренатурація інтерферону

До отриманої на попередньому етапі суспензії нерозчинної форми інтерферону додають сухий гуанідин гідрохлорид до концентрації 6 М, додають дитиотреитол до концентрації 50 мМ, Tris-HCl pH 8.0 до концентрації 50 мМ, NaCl до концентрації 150 м1 і концентрації 100 і Triton X. кімнатній температурі протягом 2 год. Нерозчинний матеріал відокремлюють при стерилізуючій фільтрації через мембрани з діаметрами пор 0.22 мікрона.

Ренатурацію інтерферону проводять шляхом повільного розведення отриманого розчину в 100-200 разів буфером 4 (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 100 мМ NaCl, 0.1 мМ ЕДТА). Після цього ренатураційну суміш інкубують при постійному перемішуванні протягом 12-15 годин при температурі 4-8°С. Далі сульфат магнію додають до концентрації 1 мМ і агрегований матеріал видаляють стерилізуючою фільтрацією через мембранний фільтр з діаметром пор 0.22 мікрона.

4 етап. Хроматографічна очистка інтерферону

Хроматографічне очищення інтерферону здійснюють у три стадії.

1. Отриманий ренатурований інтерферон на першому етапі очищають за допомогою афінної хроматографії на смолі типу Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences), іммобілізованої іонами Cu +2 . Для цього розчин інтерферону наносять на колону Cu +2 Chelating Sepharose Fast Flow і інтерферон елююють буфером 0.1 М лимонної кислоти pH 2.2.

2. На другій стадії хроматографічного очищення розчин інтерферону наносять на катіонообмінну смолу типу CM Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) та інтерферон елююють градієнтом розчинів (0.0-0.5 М NaCl) у буфері 50 мМ Nа(СН 3 .

3. Очищення мономерної форми інтерферону від залишків полімерних форм інтерферону проводять на третій стадії очищення інтерферону гель-фільтрацією на смолі типу Superdex 75 (Amersham Biosciences). Хроматографію проводять у буфері 50 мМ Na(CH 3 COO), рН 5.0, що містить 0.15М NaCl.

Описаний спосіб виділення та очищення інтерферону дозволяє отримати 4-8 г високоочищеного інтерферону за один цикл виділення протягом 7-10 днів із біомаси, отриманої з 10 л культурального середовища. Якість одержуваного інтерферону повністю відповідає вимогам "European Pharmacopoeia" для субстанції інтерферону альфа-2b, а саме:

Концентрація інтерферону не менше 2×10 8 МО/мл;

Питома активність інтерферону щонайменше 2.0×10 8 МО/мг;

Електофоретична чистота препарату не менше 99% у редукувальних та не редукувальних умовах при фарбуванні гелів сріблом;

Ізоелектрична точка виділеного інтерферону знаходиться в районі рН 5.8-6.3;

Пептидна карта виділеного інтерферону принципово не відрізняється від пептидної картки для Європейського стандарту інтерферону альфа 2b CRS;

Як випливає з наведених прикладів, група винаходу, що заявляється, дозволяє отримувати інтерферон альфа-2b з високим виходом при відносно простій і надійної технології.

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Рекомбінантна плазмідна ДНК pSX50, що кодує синтез рекомбінантного людського альфа-2b інтерферону, що характеризується тим, що вона має розмір 3218 пар основ (п.о.) і складається з наступних фрагментів: послідовність з 1 по 176 нуклеотиду (н.) включає фрагмент ДНК розміром 176 п.о., що містить триптофановий промотор (Р trp), послідовність з 177 до 194 н. включає синтетичний фрагмент ДНК розміром 18 п.о., що містить послідовність Шайн Дельгарно, відповідальний за ініціацію трансляції, послідовність з 195 до 695 н. включає фрагмент ДНК розміром 501 п.о., що містить ген інтерферону альфа-2b з нуклеотидними замінами: 37 (А>С), 39 (G>T), 40 (А>С), 42 (G>T), 67 ( А>С), 69 (G>T), 70 (А>С), 72 (А>Т), 96 (G>A), 100 (А>С), 102 (А>Т), 114 (А) >С), 120 (C>G), 126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A>) C), 489 (А>Т), 495 (G>A), послідовність з 696 по 713 н. включає синтетичний фрагмент ДНК розміром 18 п.о., що містить синтетичний полілінкер, послідовність з 714 до 1138 н. включає фрагмент ДНК плазміди рКК223-3 з 4129 до 4553 н. розміром 425 п.о., що містить послідовність суворого термінатора транскрипції rrnBT 1 T 2 послідовність з 1139 по 1229 н. включає фрагмент ДНК плазміди pUC19 з 2487 до 2577 н. розміром 91 п.о., що містить промотор гена -лактомази (ген стійкості до ампіциліну -Amp R), послідовність з 1230 до 2045 н. містить фрагмент ДНК плазміди pUC4K з 720 н. до 1535 н. розміром 816 п.о., що містить структурну область гена kan, послідовність 2046 н. за 3218 зв. включає фрагмент ДНК плазміди pUC19 з 1625 по 453 н. розміром 1173 п.н., що містить послідовність, відповідальну за реплікацію плазміди (ori) і промотора lac (P lac).

2. Штам бактерій Eschcerichia coli SX50 трансформований рекомбінантною плазмідою за п.1 – продуцент рекомбінантного лейкоцитарного інтерферону альфа-2b людини.

3. Спосіб отримання інтерферону альфа-2b людини, що включає культивування штаму Escherichia coli SX5 по п.2 в поживному середовищі з постійним додаванням поживних субстратів в процесі біосинтезу, механічне руйнування клітин мікроорганізму при тиску 700-900 bar, розчинення і , ренатурацію інтерферону у фізіологічних буферних розчинах у присутності хаотропних агентів, тристадійну хроматографічну очистку інтерферону на смолах типу Chelating Sepharose Fast Flow, іммобілізованих іонами Сu +2 хроматографію на смолах типу Superdex 75 .

4. Спосіб за п.3, в якому культивування проводять на живильному середовищі зі зниженим вмістом триптофану при безперервному додаванні поживних субстратів, переважно глюкози та дріжджового екстракту.

5. Спосіб за п.3, в якому перед розчиненням інтерферону його очищають видаленням розчинних клітинних компонентів, що включають ДНК, РНК, білки, ліпополісахариди, промиванням буферними розчинами, що містять детергенти типу Тритон XI 00 сечовин.

6. Спосіб за п.3, в якому після кожного хроматографічного очищення проводять стерилізуючу фільтрацію через фільтри з розмірами пір 0.22 мкм.