ІФА аналіз. Імуноферментний аналіз (ІФА)Enzyme immunoassay (EIA)

Перелік доступних методик діагностики в останні десятиліття швидко розширюється, діагности намагаються в нових методах поєднати переваги всіх колишніх аналізів, позбавившись усіх їхніх колишніх недоліків.

Останнім часом все частіше в переліку діагностичних процедур фігурує імуноферментний аналіз - сучасний і досить новий тест, про який мало відомо звичайній людині, яка не пов'язана з медициною. Тим не менш, ця методика стрімко поповнює ряди своїх прихильників серед кваліфікованого медперсоналу. Що вона є і в яких випадках її слід використовувати, можна спробувати розібратися, ознайомившись з її особливостями та головними характеристиками.

Імуноферментне дослідження - інструментально-лабораторна методика, побудована на молекулярній реакції антиген-антитіло, що дозволяє виявляти специфічні білки в біологічних матеріалах (зразках для дослідження). Такими білками можуть бути ензими, різноманітні мікроорганізми (віруси, бактерії, грибки), найпростіші тощо.

Після відкриття методу йому було дано назву ELISA-тест, що не має відношення до імені першовідкривачів, а є абревіатурою повної назви в англійському варіанті – enzyme-linked immunosorbent assay. Медики всього світу використовують цю назву, деякі лікарі у російськомовних країнах теж так називають цей тип дослідження.

Основний принцип методу полягає у молекулярній реакції «антиген-антитіло».

Антигеном є будь-яка чужа молекула, яка потрапила до людського організму у складі мікроба-збудника хвороби. Антигени є, як правило, білковими молекулами. Крім мікроорганізмів таким «чужинцем» можуть бути клітини чужої крові, які не збігаються за групою або резус-фактором.

У відповідь на попадання такого антигену в організмі запускається імунна реакція, спрямована на захист від будь-яких чужих молекул. Це відбувається за рахунок синтезу спеціальних агентів імунної системи – антитіл (імуноглобулінів). Кожне антитіло підходить тільки до певного антигену і нейтралізує патогенного «чужинця», зв'язуючись з ним у єдиний комплекс. Саме процес такого зв'язування називають реакцією «антиген-антитіло».

Види антитіл

Усі антитіла (імуноглобуліни) діляться на 5 видів залежно від того, на якому етапі імунної відповіді вони з'являються:

Для ІФА-діагностики найчастіше важливі рівні імуноглобулінів IgG, IgM та IgA. За їхніми титрами можна дізнатися, чи перехворіла людина на хворобу раніше або заразився в недавньому часі, чи виробився в неї імунітет чи його організм беззахисний перед патологією.

Переваги та недоліки імуноферментного аналізу

На даний момент ІФА - один із найточніших і найчутливіших методів. Він взятий на озброєння фахівцями у різних галузях медицини та продовжує розширювати сфери застосування.

Переваги методу

• Висока точність даних.
• Чутливість (дозволяє виявити необхідну речовину навіть за мінімальної присутності збудника у зразку).
• Можливість діагностики у перші дні хвороби чи в інкубаційному періоді.
• Швидкість отримання даних у порівнянні з іншими методиками такої точності.
• Висока автоматизація процесу та мінімальна участь людини, що знижує похибку виконавця.
• Отримання даних про стадії патологічного процесу та ефективність обраної терапії.
• Безболісність та мала інвазивність при відборі матеріалу.

Недоліки методу

• Найчастіше дозволяє визначати відповідь організму на патогенний агент, а чи не самого збудника.
• Перед дослідженням має бути точно відоме передбачуване захворювання, оскільки тест високоспецифічний.
• Ймовірність помилкових показників, викликаних технічними моментами, прийомом лікарських засобів, одночасною присутністю кількох хронічних захворювань або порушеннями обмінних процесів в організмі хворого.
• Інтерпретацію результатів повинен робити лише висококваліфікований фахівець, оскільки для трактування отриманих даних необхідно мати спеціальну підготовку та великий запас медичних знань у певній галузі.
• ІФА – досить рідкісний аналіз, тому виконують його далеко не у всіх діагностичних лабораторіях.
• Метод досить дорогий, оскільки окрім реактивів у лабораторії має бути дороге чисельне обладнання та зразки антигенів, що виготовляються у спеціальних інститутах.

У яких випадках використовують імуноферментний аналіз

Повний перелік показань до призначення імуноферментного дослідження дуже широкий, він включає практично всі галузі медицини.

Найчастіше ІФА застосовують для таких цілей:

• виявлення інфекційних захворювань;
• діагностика венеричних хвороб;
• визначення імунного статусу чи окремих аутоімунних захворювань;
• ідентифікація онкомаркерів;
• визначення гормонів.

У разі інфекційних та вірусних захворювань методика дозволяє виявити такі патології:

Крім того, ІФА дозволяє швидко та ефективно визначити інфарктний стан, оцінити репродуктивний потенціал організму, виявити алергію, її джерело та ін.

Імуноферментна методика використовується для проведення клінічних досліджень у ході розробки нових лікарських препаратів та оцінки їх впливу на організм людини.

Типи зразків та методи їх відбору для дослідження

Найчастіше досліджуваним матеріалом для імуноферментного аналізу є кров, яку беруть із ліктьової вени пацієнта. Відбір проби проводиться натщесерце, переважно в ранковий час. Після відбору з крові відокремлюють та видаляють ті форменні клітини, які заважають проведенню дослідження, залишаючи тільки сироватку.

При діагностуванні сечостатевих інфекцій часто матеріалом стають мазки зі слизових тканин статевих органів, слиз з уретри або шийки матки, зразки з прямої кишки, зіскрібки з ерозій або виразок в області паху та інших ділянок тіла. Мазки можуть брати і з порожнини рота, а також з носоглотки.

Іноді імуноферментне обстеження використовується в акушерській та гінекологічній практиці під час вагітності для визначення стану навколоплідних вод. У такому разі зразком стає амніотична рідина. Для цього відбирають невелику кількість рідини, проколивши плодовий міхур довгою голкою. Усі маніпуляції проводять стерильним інструментом, щоб мінімізувати ризики.

Нерідко матеріалом стає спинномозкова чи серозна рідина. Це відбувається за місцевої анестезії, яка вводиться ін'єкційно.

Уточнити, який тип матеріалів необхідний для імуноферментного аналізу, повинен спеціаліст, який спрямовує на дослідження. Часто беруться зразки відразу кількох типів чи з різних місць. Про підготовку до здачі біоматеріалу пацієнту теж має розповісти лікар, який видає направлення на цей тип обстеження.

Підготовка до імуноферментного аналізу

Для збільшення точності даних, отриманих після імуноферментного обстеження, підготовка до відбору матеріалу має бути такою:

• за 10 діб до дослідження виключити антибіотики, противірусні та антимікотичні препарати;
• за добу необхідно виключити спиртне, куріння та прийом наркотичних речовин;
• у цей період необхідно уникати фізичного перенапруження;
• попередити спеціаліста, який виписує призначення, про всі ліки, які пацієнт приймає;
• оповістити лікаря у разі вагітності чи підозри на вагітність.

Найкраще, якщо матеріали для тестування будуть відібрані вранці натще.

Якщо діагностика ставить за мету визначити стан гормонального фону, то важливо забезпечити собі спокійний стан напередодні та уникати нервової напруги. Для жінок здавання крові на гормони чітко визначається періодом місячного циклу, про що буде сказано лікарем у момент призначення.

За 2-3 дні до відбору матеріалу потрібно виключити з меню смажене та жирне, а перед аналізом на гепатит не є цитрусові та будь-які інші фрукти та овочі оранжевого та жовтого кольору.

Розшифрування результатів імуноферментного аналізу

Результат якісного дослідження, як правило, позначається знаками "+" (виявлено) або "-" (не виявлено).

За наявністю чи відсутністю певних груп імуноглобулінів можна робити такі висновки:

• JgM(-), JgG(-), JgA(-) - імунітет до захворювання повністю відсутня (з таким типом антигену організм раніше не стикався);
• JgM(-), JgG(+), JgA(-) - раніше було зіткнення з даним антигеном або з вакциною;
• JgM(+), JgG(-/+), JgA(-/+) - гострий патологічний процес (швидше за все первинний);
• JgM(-), JgG(+/-), JgA(+/-) - процес хронічної течії;
• JgM(+), JgG(+), JgA(+) - рецидив;
• JgM (-) – стадія одужання.

Кількісні значення мають велике інформаційне навантаження, але трактувати їх здатний тільки лікар, виходячи з попередніх показань, віку пацієнта, норм для кожного конкретного захворювання. Саме з цієї причини оцінювати результати самостійно не можна.

Скільки необхідно чекати на результати

Дана методика має багато різновидів, залежно від яких визначається термін отримання даних на руки. Середня тривалість ІФА-діагностики становить 4-6 годин, що дозволяє видати результати вже наступного дня.

Найтриваліші методики займають до 10 днів, наприклад, у разі виявлення ВІЛ-інфекції.

При гострій необхідності можливе застосування експрес-методик, у яких відповідь отримують вже через 1-2 години.

Де можна пройти ІФА тестування

Оскільки обладнання для проведення такого типу діагностики є досить дорогим, то придбати його можуть не всі лабораторії. Крім того, тести, що містять специфічні антигени, мають обмежений термін придатності (зазвичай близько 1 року), тому потребують постійного оновлення.

З цих причин у державних медичних закладах ІФА-лабораторії є далеко не завжди. Найчастіше необхідно звертатися до великих приватних медичних чи великих діагностичних центрів.

Для проведення ІФА-дослідження лабораторія повинна мати спеціальну ліцензію, а персонал та лаборанти мають пройти спеціальне навчання.

Найчастіше конкретний діагностичний центр чи лабораторію рекомендує лікар, який спрямовує пацієнта на обстеження.

Вартість імуноферментного дослідження

Ціна на це дослідження залежить від регіону країни та від рівня клініки, що надає послугу. У Москві мінімальна ціна визначення одного антигену стартує від 700 крб. Якщо необхідно виявити відразу кілька імуноглобулінів, то ціна сумуватиметься.

У разі термінового аналізу ціна зростає на 150-200 руб. за кожний антиген.

Незважаючи на досить високу вартість, імуноферментний аналіз дозволяє зробити обстеження пацієнта максимально інформативним та швидким, що скорочує час до початку лікування та дозволяє швидше стабілізувати стан людини.

На цьому відео представлений фільм "Основи імуноферментного аналізу".

Іноді лікарі призначають аналізи ІФА, що це таке знають далеко не всі. ІФА розшифровку має таку – імуноферментний аналіз крові. Таке дослідження крові допомагає зрозуміти, як організм бореться із хворобами інфекційного спектру та продемонструвати фазу захворювання. Імуноферментне дослідження допомагає в оцінці захисної діяльності крові, виявленні імунодефіциту при патологіях, пов'язаних з інфекціями, гормональних проблем тощо.

Аналіз крові ІФА працює з матеріалом, який забирається із вени. Крім цього, доступний для дослідження вміст склоподібного тіла, рідина зі спинного мозку, мазки з уретри або цервікального каналу. Для імуноферментного аналізу ІФА у вагітних жінок можуть забирати рідину, якою оточений плід.

При цьому безпосередньо кров ІФА може перевірятися з використанням різних технік. Є прямий, непрямий спосіб, конкуренція та блокування. При зараженні організму якимось хвороботворним агентом, який називається антигеном, імунітет починає виробляти специфічні антитіла, наприклад, гепатит. Ці антитіла спрямовані на те, щоби «розібратися» з чужорідними агентами. Що таке антитіла? Це спеціальні білки, які можуть вступати у зв'язок з антигенами і утворювати комплекси імунологічної спрямованості, які називаються антиген-антитіло. Саме виявлення цих комплексів і відповідає ІФА діагностика.Щоб виявити антиген, до отриманого зразка крові додаються антитіла або виконується зворотна процедура.

ІФА позитивний результат будується на реакції імунітету та ферментів. Під дією першої агенти інфекцій та клітинні елементи зв'язуються, друга допомагає візуалізувати результат першої. Імунна реакція передбачає антитільну та антигенну зв'язку. Внаслідок цього процесу і формується комплекс імунної спрямованості. Усі клітини своєї поверхні мають антиген. Імунною клітиною здійснюється захоплення підозрілою, а антиген, який закріплений на поверхні, проходить процедуру порівняння з інформацією, яка завантажена в пам'ять. Якщо є збіги описи, то клітина повертається додому, якщо ж ні, то відбувається зв'язок, за створення якого відповідає антитіло, яке кріпиться до поверхні.

Ферментативна реакція тим часом дозволяє речовинам перетворитися на нові. На матеріал виконується дія ферментом. У цьому ферментальне різницю забезпечується різними субстратами. Продукт, який став наслідком цієї реакції, вирушає визначення кількості збудника, визначення якого грунтується на щільності розчинного забарвлення.

Особливості методу

Імуноферментний аналіз крові призначається, коли необхідно діагностувати алергію, хвороби, що мають вірусне походження. Є й аналіз ІФА на сифіліс та низку інших інфекцій, передача яких відбувається при незахищеному статевому контакті. Така діагностика стає дедалі популярнішою порівняно з ПЛР. Справа в тому, що ПЛР передбачає роботу з мазками. На відміну від ПЛР, результати ІФА можуть бути отримані при кров'яних перевірках.

Крім цього, аналіз крові методом ІФА може призначатися, коли потрібно встановити наявність імунодефіциту, діагностувати онкологію, дати оцінку тому, наскільки ефективно лікування, визначити гормональний рівень та пройти передопераційне обстеження у комплексі.

Якщо порівнювати дослідження методом ІФА, наприклад, з ПЛР, можна виявити низку переваг. Основним є можливість повної діагностики навіть на ранніх стадіях розвитку. Крім цього, результати ІФА допомагають у визначенні конкретної стадії захворювання, на якому рівні знаходиться його розвиток.

ІФА аналіз у порівнянні з ПЛР має більш високу ефективність, крім того, здавати його можна під час вагітності, щоб виявити ЗПСШ. Той, хто здав цей аналіз, може дізнатися про концентрацію ТТГ у сироватці крові. Це дуже важливо, щоб перевірити, якою є реакція щитовидної залози, чи присутні збої в її роботі.

Додатковими достоїнствами, втім, їх має і полімеразна ланцюгова реакція, є швидкість дослідження, а значить, швидке отримання результатів. Достойно оцінюють лікарі та точність результатів. Якщо йдеться про ЗПСШ, то рівень сягає 98 відсотків, як і у випадку з концентрацією ТТГ.

Звісно, ​​без недоліків не обходиться. Однак у цьому випадку йдеться про непрямі особливості тесту. Зокрема, йдеться про те, що не можна виключити можливі помилки щодо норм. Іноді аналіз, який здавала абсолютно здорова дівчина, може продемонструвати хибнопозитивний результат, або негативний у протилежному випадку. Проте класифікація методів психологічного дослідження найчастіше пов'язує такі недоліки з неправильною підготовкою чи порушенням техніки, з якою виконувався забір матеріалу.

Особливості виконання

При ІФА аналізі здебільшого здається кров. Перед здаванням крові важливо витримати щонайменше восьмигодинне голодування, виключити прийом низки медичних препаратів, які впливають результат аналізу. Йдеться про антигістамінні медикаменти та гормональні препарати, що впливають на роботу щитовидки. Крім цього, виключений має бути алкоголь не менше ніж за добу. Забезпечте відсутність куріння не менше ніж за годину до крові. Спотворення результату можливе і при прийомі наркотичних речовин.

Перш ніж перейти до розшифровки, варто згадати, які методи вимірювання використовуються для такого тесту. В результаті аналізу будуть вказуватись антитіла або імуноглобуліни Ig. Під ними розуміються ті самі специфічні білки, про які раніше йшлося. За вироблення їх відповідають В-лімфоцити, як тільки в організм потрапляють віруси, бактерії чи грибки. Виділяється п'ять видів імуноглобулінів, що позначаються латиницею.

Відмінності їх пов'язані з різною молекулярною формою та масою. У них різний період напіврозпаду, по-різному бере участь або не приймається в інфекційних процесах. Варіюються і терміни, у яких їх можна виявити з моменту, як відбулося інфікування.

Якщо класифікувати імуноглобуліни, використовуючи як основу молекулярну вагу, то найбільші показники у IgM. Особливістю такого типу імуноглобулінів є можливість проходження через плацентарний бар'єр. Якщо IgM виявляється в аналізі у новонародженої дитини, йдеться про наявність інфекції у плода.

У переважній більшості крові в людини містяться імуноглобуліни IgG, найменше IgE. Говорячи про роботу в рамках інфекційних процесів, особливе значення варто приділяти варіантам A, M, G. IgE виступає як маркер алергічної реакції. IgD виявляється тільки в тканинах лімфовузлів та мигдаликів. Це важливо з погляду створення імунітету місцевого рівня.

Крім цього, в аналізі визначаються антигени. Під ними розуміються речовини високомолекулярного типу, відомі своїм органічним походженням. Зокрема, йдеться про збудників захворювань інфекційного та іншого спектру. Крім цього, маються на увазі і речовини, що сигналізують про різні зміни клітин, які неминучі за цілого ряду хвороб. Також вказується і імунний комплекс, який демонструє комплекс антиген-антитіло, яким бере участь у імунному процесі.

Зазвичай термін виготовлення залежить від конкретної лабораторії, до якої ви звернулися. Ряд лабораторій може надати результати протягом дня-двох, іншим потрібен тиждень. Затримки можуть бути пов'язані з необхідністю накопичити певну кількість сироватки.

Вплив на результати та розшифровка

Незважаючи на те, що ІФА вважається одним із найбільш точних методів перевірки, похибки таки трапляються. Вплинути на правильність результатів може процедура взяття матеріалу, неправильне його транспортування та зберігання матеріалу. Прийом медикаментів, як зазначалося вище, присутність прихованих захворювань. Порушення обміну речовин чи імунодефіцит теж дозволять отримати правильні показники. У період до року у новонароджених теж можуть бути не зовсім вірні показники. Пов'язано це з тим, що в організмі є материнські антитіла.

Говорячи про розшифровку, в бланках аналізу використовується позитивний або негативний знак, яким позначаються результати обчислення кожного з імуноглобулінних класів. Як можливих варіантів виступатимуть такі.

Відсутність виявлених IgG, IgA та IgM говорить про повне одужання. Негативний результат таких компонентів як IgM, IgA, IgG – це відсутність імунітету до інфекції.

Поєднання позитивного і негативного результату IgG, IgA в комплексі з позитивним IgM говорить про присутність в організмі інфекції в гострій формі. Позитивний результат IgG, що комбінується негативними показниками за IgA та IgM, відповідає поствакцинальному періоду або придбання імунітету в результаті перенесеної інфекції.

Поєднання позитивного або негативного результату IgG, IgA та негативного результату IgM говорить про присутність інфекції в хронічному її перебігу. Позитивний результат за трьома компонентами: IgG, IgM, IgA означає загострення інфекції, яка перебувала у хронічній формі перебігу. Крім безпосередньо уточнення антитілових класів, у рамках розшифровки аналізу ІФА лікар отримує інформацію про їх кількісні показники. Важливо підкреслити, що за розшифровку повинен відповідати лікар. Справа в тому, що поєднання деяких компонентів може наштовхнути його на думку про отриманий хибний результат, що призведе до повторної здачі. Самостійна розшифровка в такому разі марна.

Аналіз ІФА (імуноферментне дослідження) – сучасна діагностична процедура, спрямована на виявлення в крові специфічних антитіл до збудників низки захворювань, визначення стадії розвитку патології та її етіології. Застосовується як метод контролю над процесом лікування та його ефективністю. У процесі дослідження аналізуються якісні та кількісні показники.

Метод ІФА має високу інформативність, точність результатів становить понад 96%. Діагностика доступна практично в будь-якій лабораторії та медичній установі.

Основні свідчення

Імуноферментне дослідження призначається з метою підтвердження наявності інфекційних захворювань, що передаються статевим шляхом:

• трихомоніазу;
• хламідіозу;
• уреаплазмозу;
• сифілісу та ін.

Також ІФА застосовується для діагностики вірусних захворювань:

• герпесу;
• герпесу 4 типу (вірус Епштейна-Барра);
• вірусного гепатиту;
• цитомегаловірусної інфекції.

Як підготуватися до дослідження

Біологічним матеріалом дослідження служить кров. За кілька днів до її здавання виключається прийом медикаментозних препаратів. За 14 днів зупиняється прийом антибіотиків, протигельмінтних та противірусних засобів.

Забір матеріалу здійснюється вранці натще. За годину до процедури дозволяється випити склянку води без газу, їду виключається.

Особливості аналізу

Для проведення дослідження береться венозна кров, обсягом щонайменше 5 мл. В окремих випадках як біоматеріал використовується спинномозковий ліквор, амніотична рідина або вміст склоподібного тіла.

Забір крові здійснюється за допомогою ін'єкційної голки, строго натщесерце, з метою уникнення хибнопозитивних результатів. За 12 годин слід відмовитися від куріння та прийому алкогольних напоїв. При вживанні наркотичних речовин результати аналізу спотворюються.

Якщо у висновку вказані негативні значення імуноглобулінів G, А, М, це говорить про початкову фазу розвитку патологічного процесу або про його відсутність. Такий результат реєструється за повного одужання на тлі проведеної терапії.

Негативний результат IgM та IgA та позитивний IgG говорять про формування імунітету після інфекційного захворювання або вакцинації.

Позитивний результат IgM та негативний або позитивний результат IgG, IgA свідчать про наявність гострої інфекційної патології.

Аналіз ІФА проводиться досить швидко, результати готові через добу після забору матеріалу.

Як проводиться дослідження методом ІФА

Механізм реакції

В основі імуноферментного аналізу лежить імунна реакція антигену з антитілом, а приєднання до антитіл ферментної мітки дозволяє враховувати результат реакції антиген-антитіло за появою ферментативної активності або зміни її рівня.

Підрахунок результатів

Проведення імуноферментного аналізу

Для серодиагностики використовуються 96 лункові полістирольні планшети, на стінках осередків яких заздалегідь адсорбується антиген. Досліджувана сироватка вноситься в комірку планшета. При цьому гомологічні антигени антитіла прикріплюються до нього. Антитіла, що не прикріпилися, видаляються промиванням. Далі в осередки вносять антитіла проти імуноглобулінів (антитіл) людини, мічені ферментом. Якщо в досліджуваній сироватці були визначені антитіла, то вони на цьому етапі виступлять у ролі антигенів, з якими прореагують мічені антитіла. Додавання після промивання хромогенної речовини (барвника) дозволить врахувати реакцію по фарбуванню, що розвивається в осередках. Інтенсивність забарвлення при цьому пропорційна кількості ферменту, а отже кількості антитіл. для кожної тест-системи є свої показники обліку результатів та показники норми та патології на які треба орієнтуватися при інтерпретації результатів.

Які інфекції можна виявити методом ІФА

В основному в сучасній венерології застосовується для діагностики сифілісу (в комплексі з іншими реакціями), ВІЛ-інфекції, вірусних гепатитів. Має обмежене значення для діагностики хламідійної інфекції, цитомегаловірусної інфекції та інших герпетичних інфекцій. рівня гормонів, автоантитіл і різних маркерів онкологічних захворювань.

Як інтерпретувати результати ІФА

Дослідження наявності та рівня антитіл різних класів у деяких випадках допомагає визначити стадії інфекційного процесу

На жаль, така важлива перевага ІФА як кількісне визначення антитіл не має великого значення в практичній роботі - тобто. не дозволяє точно встановити діагноз і не впливає на дозування та термін призначення лікарських засобів.

Яка роль метод ІФА у діагностиці сифілісу

Метод ІФА в діагностиці сифілісу був вперше застосований в 1975. В даний час він широко застосовується для серологічної діагностики сифілісу в Росії і використовується як підтверджує тест на сифіліс. Зазвичай проводять дослідження, що виявляє так звані сумарні антитіла до антигенів блідої трепонеми (IgM і хоча в окремих випадках можливе і визначення тільки "ранніх" антитіл класу М.ІФА при сифілісі стає позитивним після 3 тижня з моменту інфікування і залишається позитивним досить тривалий час навіть після лікування (іноді все життя). ІФА немає. У більшості випадків проводиться лише якісне визначення ІФА - тобто. лише позитивний чи негативний результат, хоча й кількісне визначення.