Фагоцитоз та визначення фагоцитарної активності. Клітини-макрофаги: розвиток, поширення, функції та захворювання Навіщо потрібно активізувати тканинні макрофаги
Стаття на конкурс «біо/мол/текст»:Імунна система - це потужний багатошаровий захист нашого організму, який надзвичайно ефективний проти вірусів, бактерій, грибів та інших патогенів ззовні. Крім того, імунітет здатний ефективно розпізнавати та знищувати трансформовані власні клітини, які можуть перероджуватись у злоякісні пухлини. Однак збої в роботі імунної системи (з генетичних або інших причин) призводять до того, що одного разу злоякісні клітини беруть гору. Пухлина, що розрослася, стає нечутливою до атак організму і не тільки успішно уникає знищення, а й активно «перепрограмує» захисні клітини для забезпечення власних потреб. Зрозумівши механізми, які пухлина використовує для придушення імунної відповіді, ми зможемо розробити контрзаходи та спробувати зрушити баланс у бік активації власних захисних сил для боротьби з хворобою.
Ця стаття представлена на конкурс науково-популярних робіт «біо/мол/текст»-2014 у номінації «Кращий огляд».
Головний спонсор конкурсу - далекоглядна компанія Генотек.
Конкурс підтримано ВАТ «РВК».
Пухлина та імунітет - драматичний діалог у трьох частинах з прологом
Довгий час вважалося, що причина низької ефективності імунної відповіді при раку - те, що пухлинні клітини надто схожі на нормальні, здорові, щоб імунна система, налаштована на пошук «чужинців», могла їх як слід розпізнавати. Цим якраз і пояснюється той факт, що імунна система найуспішніше протистоїть пухлинам вірусної природи (їх частота різко зростає у людей, які страждають на імунодефіцит). Проте пізніше зрозуміли, що це єдина причина.
Якщо в цій статті йдеться про імунні аспекти раку, то в роботі «Страшною клішнею на світі немає...»можна прочитати про особливості ракового метаболізму. – Ред.
Виявилося, що взаємодія ракових клітин з імунною системою має набагато більш різнобічний характер. Пухлина не просто «ховається» від атак, вона вміє активно придушувати місцеву імунну відповідь та перепрограмувати імунні клітини, змушуючи їх обслуговувати власні злоякісні потреби.
«Діалог» між клітиною, що переродилася, вийшла з-під контролю з її потомством (тобто майбутньою пухлиною) і організмом розвивається в кілька стадій, і якщо спочатку ініціатива майже повністю перебуває на боці захисних сил організму, то в кінці (у разі розвитку хвороби) - Переходить на бік пухлини. Кілька років тому вченими-онкоімунологами було сформульовано концепцію «імуноредагування» ( immunoediting), що описує основні етапи цього процесу (рис. 1).
Малюнок 1. Імуноредагування (immunoediting) у процесі розвитку злоякісної пухлини.
Перша стадія імуноредагування - процес усунення ( elimination). Під впливом зовнішніх канцерогенних чинників чи результаті мутацій нормальна клітина «трансформується» - набуває здатність необмежено ділитися і відповідати регуляторні сигнали організму. Але при цьому вона зазвичай починає синтезувати на своїй поверхні особливі «пухлинні антигени» і «сигнали небезпеки». Ці сигнали залучають клітини імунної системи, насамперед макрофаги, натуральні кілери та Т-клітини. У більшості випадків вони успішно знищують клітини, що «зіпсувалися», перериваючи розвиток пухлини. Однак іноді серед таких «передракових» клітин виявляється кілька таких, у яких імунореактивність – здатність викликати імунну відповідь – з якихось причин виявляється ослабленою, вони синтезують менше пухлинних антигенів, гірше розпізнаються імунною системою і, переживши першу хвилю імунної відповіді, продовжують ділитися.
В цьому випадку взаємодія пухлини з організмом виходить на другу стадію, стадію рівноваги ( equilibrium). Тут імунна система вже не може повністю знищити пухлину, але ще може ефективно обмежувати її зростання. У такому "рівноважному" (і не виявляється звичайними методами діагностики) стані мікропухлини можуть існувати в організмі роками. Однак такі пухлини, що затаїлися, не статичні - властивості складових їх клітин поступово змінюються під дією мутацій і наступного відбору: перевагу серед пухлинних клітин, що діляться, отримують такі, які здатні краще протистояти імунній системі, і врешті-решт у пухлини з'являються клітини. імуносупресори. Вони можуть не тільки пасивно уникати знищення, а й активно придушувати імунну відповідь. По суті, це еволюційний процес, в якому організм мимоволі виводить саме той вид раку, який його вб'є.
Цей драматичний момент знаменує собою перехід пухлини до третьої стадії розвитку - уникнення ( escape), - де пухлина вже малочутлива до активності клітин імунної системи, більше - звертає їх активність собі на користь. Вона починає рости і метастазувати. Саме така пухлина зазвичай діагностується медиками та вивчається вченими - дві попередні стадії протікають приховано, і наші уявлення про них засновані головним чином на інтерпретації цілого ряду непрямих даних.
Дуалізм імунної відповіді та її значення в канцерогенезі
Існує безліч наукових статей, що описують, як імунна система бореться з пухлинними клітинами, але не менша кількість публікацій демонструє, що присутність клітин імунної системи в найближчому пухлинному оточенні є негативним фактором, що корелює з прискореним зростанням та метастазування раку. У рамках концепції імуноредагування, що описує, як змінюється характер імунної відповіді в міру розвитку пухлини, подібна подвійна поведінка наших захисників отримала нарешті своє пояснення.
Ми розглянемо деякі механізми того, як це відбувається на прикладі макрофагів. Подібні прийоми пухлина використовує і для того, щоб обдурювати інші клітини вродженого та набутого імунітету.
Макрофаги - «клітини-воїни» та «клітини-цілювачі»
Макрофаги, мабуть, найвідоміші клітини вродженого імунітету - саме з вивчення їх здібностей до фагоцитозу Мечниковим і почалася класична імунологія клітинна. В організмі ссавців макрофаги - бойовий авангард: першими виявляючи ворога, вони намагаються знищити його власними силами, але й залучають до місця бою інші клітини імунної системи, активуючи їх. А після знищення чужорідних агентів приймаються брати активну участь у ліквідації заподіяних ушкоджень, виробляючи фактори, що сприяють загоєнню ран. Цю подвійну природу макрофагів пухлини використовують собі на користь.
Залежно від переважаючої активності розрізняють дві групи макрофагів: М1 та М2. М1-макрофаги (їх ще називають класично активованими макрофагами) – «воїни» – відповідають за знищення чужорідних агентів (у тому числі і пухлинних клітин), як безпосередньо, так і за рахунок залучення та активації інших клітин імунної системи (наприклад, Т-кілерів ). М2 макрофаги - «цілювачі» - прискорюють регенерацію тканин і забезпечують загоєння ран.
Присутність у пухлини великої кількості М1-макрофагів гальмує її зростання, а в деяких випадках може викликати навіть практично повну ремісію (знищення). І навпаки: М2-макрофаги виділяють молекули – фактори росту, які додатково стимулюють поділ пухлинних клітин, тобто сприяють розвитку злоякісної освіти. Експериментально було показано, що в пухлинному оточенні зазвичай переважають саме М2-клітини (цілювачі). Гірше того: під дією речовин, що виділяються пухлинними клітинами, активні М1-макрофаги «перепрограмуються» в М2-тип, перестають синтезувати антипухлинні цитокіни, такі як інтерлейкін-12 (IL12) або фактор некрозу пухлин (TNF) і починають виділяти в навколишнє середовище молекул , що прискорюють зростання пухлини та проростання кровоносних судин, які забезпечуватимуть її харчування, наприклад фактор росту пухлин (TGFb) та фактор росту судин (VGF). Вони перестають залучати та ініціювати інші клітини імунної системи та починають блокувати місцеву (протипухлинну) імунну відповідь (рис. 2).
Малюнок 2. М1- та М2-макрофаги:їх взаємодія з пухлиною та іншими клітинами імунної системи.
Ключову роль цьому перепрограмуванні грають білки сімейства NF-kB . Ці білки є транскрипційними факторами, що контролюють активність безлічі генів, необхідні М1 активації макрофагів. Найбільш важливі представники цього сімейства - р65 і р50, що разом утворюють гетеродимер р65/р50, який в макрофагах активує безліч генів, пов'язаних з гострим запальним відповіддю, таких як TNF, багато інтерлейкіни, хемокіни та цитокіни. Експресія цих генів приваблює дедалі нові імунні клітини, «підсвічуючи» їм район запалення. У той же час інший гомодимер сімейства NF-kB - р50/р50 - має протилежну активність: зв'язуючись з тими ж промоторами, він блокує їх експресію, знижуючи градус запалення.
І та, і інша активність NF-kB транскрипційних факторів дуже важлива, але ще важливіша рівновага між ними. Було показано, що пухлини цілеспрямовано виділяють речовини, які порушують синтез білка p65 в макрофагах і стимулюють накопичення інгібіторного комплексу р50/р50 . Таким способом (крім ще ряду інших) пухлина перетворює агресивних М1-макрофагів на мимовільних посібників свого власного розвитку: М2-тип макрофагів, сприймаючи пухлину як пошкоджену ділянку тканини, включають програму відновлення, проте секретовані ними фактори зростання тільки додають ресурси для зростання пухлини. На цьому цикл замикається - пухлина, що росте, приваблює нові макрофаги, які перепрограмуються і стимулюють її зростання замість знищення.
Реактивація імунної відповіді - актуальний напрямок антиракової терапії
Таким чином, у найближчому оточенні пухлин є складна суміш молекул: як активуючих, так і інгібуючих імунну відповідь. Перспективи розвитку пухлини (отже, перспективи виживання організму) залежить від балансу інгредієнтів цього «коктейлю». Якщо переважатимуть імуноактиватори - значить, пухлина не впоралася із завданням і буде знищена або її зростання сильно загальмується. Якщо переважають імуносупресорні молекули - це означає, що пухлина змогла підібрати ключ і почне швидко прогресувати. Розуміючи механізми, які дозволяють пухлинам придушувати наш імунітет, ми зможемо розробити контрзаходи та зрушити баланс у бік знищення пухлин.
Як свідчать експерименти, «перепрограмування» макрофагів (та інших клітин імунної системи) оборотне. Тому одним із перспективних напрямків онко-імунології на сьогоднішній день є ідея «реактивації» власних клітин імунної системи пацієнта з метою посилення ефективності інших методів лікування. Для деяких різновидів пухлин (наприклад, меланом) це дозволяє досягти вражаючих результатів. Інший приклад, виявлений групою Меджитова, - звичайний лактат, молекула, яка виробляється при нестачі кисню в пухлинах, що швидко ростуть за рахунок ефекту Варбурга. Ця проста молекула стимулює перепрограмування макрофагів, змушуючи їх підтримувати зростання пухлини. Лактат транспортується всередину макрофагів через мембранні канали, і потенційна терапія полягає у блокуванні цих каналів.
Макрофаги з'являються в осередку ушкодження протягом 24 годин з початку запальної реакції. Активовані макрофаги здійснюють транскрипцію антигенів (бактерій, ендотоксинів та ін.). За допомогою цього механізму вони представляють антигени лімфоцитів, сприяють їх активації та проліферації. Активовані Т-лімфоцити набувають значно більших цитотоксичних і цитолітичних властивостей, різко збільшують продукцію цитокінів. В-лімфоцити починають продукувати специфічні антитіла. Через активацію лімфоцитів різко збільшується продукція цитокінів та інших медіаторів запалення, виникає гіперцитокінемія. Включення активованих макрофагів у запалення, що розвивається, є гранню між локальною і системною реакцією на запалення.
Взаємодія макрофагів з Т-лімфоцитами та клітинами "натуральних кілерів" за посередництвом цитокінів забезпечує необхідні умови для знищення бактерій та знешкодження ендотоксинів, локалізації запалення, запобігання генералізації інфекції. Важливу роль захисту організму від інфекції грають натуральні (природні) клітини-киллеры (Natural Killer - NK-клетки). Вони походять з кісткового мозку і є субпопуляцією великих гранулярних лімфоцитів, здатних на відміну від Т-кілерів лізувати бактерії та клітини-мішені без попередньої їх сенсибілізації. Ці клітини, так само як макрофаги, видаляють із крові чужі організму частинки та мікроорганізми, забезпечують адекватну продукцію медіаторів запалення та місцевий захист від інфекції, зберігають баланс між прозапальними та антизапальними медіаторами запалення. Таким чином вони перешкоджають порушенню мікроциркуляції та пошкодженню паренхіматозних органів надмірною кількістю цитокінів, що продукуються, локалізують запалення, попереджають розвиток важкої загальної (системної) реакції життєво важливих органів у відповідь на запалення, перешкоджають розвитку дисфункції паренхіматозних органів.
Велике значення для регуляції гострого запалення через посередництво фактора некрозу пухлини мають молекули білка, відомі під назвою "ядерний фактор каппа В" (Nuclear factor k-kappa В), що відіграють важливу роль у розвитку синдрому системної реакції на запалення та синдрому поліорганної дисфункції. У терапевтичних цілях можна обмежити активацію даного фактора, що призведе до зниження продукції медіаторів запалення та може мати сприятливий ефект, зменшивши пошкодження тканин медіаторами запалення та знизивши небезпеку розвитку дисфункції органів.
Роль клітин ендотелію у розвитку запалення.Клітини ендотелію є сполучною ланкою між клітинами паренхіматозних органів і циркулюючими в кровоносному руслі тромбоцитами, макрофагами, нейтрофілами, цитокінами та їх розчинними рецепторами, тому ендотелій мікроциркуляторного русла тонко реагує як на зміни концентрації меді.
У відповідь на пошкодження клітини ендотелію продукують монооксид азоту (N0), ендотелії, фактор активації тромбоцитів, цитокіни та інші медіатори. Ендотеліальні клітини знаходяться у центрі всіх реакцій, що розвиваються при запаленні. Саме ці клітини після стимуляції їх цитокінами набувають здатності "спрямовувати" лейкоцити до місця ушкодження.
Активовані лейкоцити, що знаходяться в судинному руслі, здійснюють обертальні рухи по поверхні ендотелію мікроциркуляторного русла; виникає крайове стояння лейкоцитів. На поверхні лейкоцитів, тромбоцитів та клітин ендотелію утворюються адгезивні молекули. Клітини крові починають прилипати до стінок венул, рух їх зупиняється. У капілярах утворюються мікротромби, що складаються з тромбоцитів, нейтрофілів та фібрину. Внаслідок цього спочатку у зоні вогнища запалення порушується кровообіг у мікроциркуляторному руслі, різко підвищується проникність капілярів, з'являється набряк, полегшується міграція лейкоцитів межі капілярів, виникають типові ознаки місцевого запалення.
При тяжкій агресії відбувається гіперактивація клітин, що продукують цитокіни та інші медіатори запалення. Кількість цитокінів і монооксиду азоту збільшується не тільки в осередку запалення, але й за його межами в крові, що циркулює. У зв'язку з надлишком цитокінів та інших медіаторів у крові тією чи іншою мірою ушкоджується мікроциркуляторна система органів і тканин поза первинного вогнища запалення. Порушується функція життєво важливих систем та органів, починає розвиватися синдром системної реакції на запалення(SIRS).
При цьому на тлі виражених місцевих ознак запалення виникає порушення функції дихальної та серцево-судинної систем, нирок, печінки та запалення протікає як тяжке загальне захворювання із залученням усіх функціональних систем організму.
Цитокіниє порівняно великі молекули білка з молекулярною масою від 10 000 до 45 000 дальтон. За хімічною структурою вони близькі один до одного, проте мають різні функціональні властивості. Вони забезпечують взаємодію між клітинами, що беруть активну участь у розвитку місцевої та системної реакції на запалення шляхом посилення або пригнічення здатності клітин продукувати цитокіни та інші медіатори запалення.
Цитокіни можуть впливати на клітини-мішені - ендокринну, паракринну, аутокринну і ін теркірінну дію. Ендокринний фактор виділяється клітиною і впливає на клітину-мішень, розташовану від неї на значній відстані. Він доставляється до клітини-мішені струмом крові. Паракринний фактор виділяється клітиною і впливає тільки на близькі клітини. Аутокринний фактор виділяється клітиною та впливає на ту ж клітину. Інтеркринний фактор діє всередині клітини, не виходячи за її межі. Багато авторів розглядають ці взаємини як "мікроендокринну систему".
Цитокіни продукуються нейтрофілами, лімфоцитами, клітинами ендотелію, фібробластами та іншими клітинами.
Цитокінова системавключає 5 великих класів сполук, об'єднаних за їх домінуючою дії на інші клітини.
1. Цитокіни, що продукуються лейкоцитами та лімфоцитами, називають
інтерлейкінами (ІЛ, IL), тому що, з одного боку, вони продукують
ся лейкоцитами, з іншого - лейкоцити є клітинами-мішенями для
ІЛ та інших цитокінів.
Інтерлейкіни поділяють на п розапальні(ІЛ-1,6,8,12); антизапальні (ІЛ-4,10,11,13 та ін).
2. Чинник некрозу пухлини [ФНП].
3. Фактори зростання та диференціювання лімфоцитів.
4. Фактори, що стимулюють зростання популяцій макрофагів та гранулоцитів.
5. Фактори, що викликають зростання мезенхімальних клітин.
Більшість цитокінів відноситься до ІЛ (див. таблицю).
Таблиця
| Пептиди | Місце синтезу | Клітини-мішені | Функція |
| G-CSF GM-CSF (ідентичний за ефектом ІЛ-3) Інтерферони-аль-фа, бета, гама ІЛ-1 | Фібробласти, моноцити Ендотелій, фібробласти, кістковий мозок, Т-лімфоцити Епітеліальні клітини, фібробласти, лімфоцити, макрофаги, нейтрофіли | Попередник CFU-G Попередники клітин гранулоцитів, еритроцитів, моноцитів CFU-GEMM, MEG, GM Лімфоцити, макрофаги, інфіковані та ракові клітини Моноцити, макрофаги, Т та В-клітини | Підтримує продукцію нейтрофілів Підтримує проліферацію макрофагів, нейтрофілів, еозинофілів та колоній, що містять моноцити, підтримує тривалу стимуляцію кісткового мозку. Пригнічує проліферацію вірусів. Активує дефективні фагоцити, пригнічує розмноження ракових клітин, активує Т-кілери, пригнічує синтез колагенази. Стимулює Т-, В-, NK- та LAK-клітини. Заохочує активність і продукцію цитокінів, здатних руйнувати пухлину, стимулює продукцію ендогенного пірогену (через виділення простагландину PGE 2). Заохочує виділення стероїдів, білків ранньої фази запалення, гіпотензію, хемотаксис нейтрофілів. Стимулює респіраторний вибух |
| ІЛ-1га | Моноцити | Блокує рецептори ІЛ-1 на Т-клітинах, фібробластах, хондроцитах, ендотеліальних клітинах. | Блокує рецептори типу ІЛ-1 на Т-клітинах, фібробластах, хондроцитах, ендотеліальних клітинах. Покращує в експерименті модель септичного шоку, артриту та запалення кишечника |
| ІЛ-2 | Лімфоцити | Т, NK, В-активовані моноцити | Стимулює зростання Т-, В- та NK-клітин |
| ІЛ-4 | Т-, N К-клітини | Всі гематопоетичні клітини та багато інших, експрес-рецептори | Стимулює зростання Т- та В-клітин, продукцію молекул HLA-клас 11 |
| ІЛ-6 | Клітини ендотелію, фібробласти, лімфоцити, деякі пухлини | Т-, В- та плазматичні клітини, кератиноцити, гепатоцити, стовбурові клітини | Диференціація В-клітин, стимуляція росту Т-клітин та гематопоетичних стовбурових клітин. Стимулює продукцію білків ранньої фази запалення, зростання кератиноцитів. |
| ІЛ-8 | Клітини ендотелію, фібробласти, лімфоцити, моноцити | Базофіли, нейтрофіли, Т-клітини | Викликає експресію LECAM-1 рецепторів ендотеліальними клітинами, бета-2-інтегринів та трансміграцію нейтрофілів. Стимулює респіраторний вибух |
| M-CSF | Клітини ендотелію, фібробласти, моноцити | Попередник моноцитів CFU-M Моноцити | Підтримує проліферацію моноцитформуючих колоній. Активує макрофаги |
| МСР-1, MCAF | Моноцити. Деякі пухлини секретують аналогічні пептиди Макрофаги | Неактивовані моноцити | Відомі лише специфічні хемоатрактанти моноцитів |
| TNF-alfa (LT має ідентичний ефект) | NK-, Т-клітини, В-клітини (LT) | Клітини ендотелію, моноцити, нейтрофіли | Стимулює зростання Т-лімфоцитів. Спрямовує цитокін до деяких клітин пухлини. Різко виражений прозапальний ефект шляхом стимуляції ІЛ-1 та простагландин Е-2. При введенні тваринам в експерименті викликає численні симптоми сепсису. Стимулює респіраторний вибух та фагоцитоз |
Список скорочень термінів у таблиці
| Англійська | росіян | Англійська | росіян | ||
| CFE | Колонієформуюча одиниця | КФЕ | MCAF | Моноцит хемотаксис та активуючий фактор | МХАФ |
| G-CSF | Гранулоцит колонієстимулюючий фактор | Г-КСФ | M-CSF | Макрофаг колонієстимулюючий фактор | М-КСФ |
| GM-CSF | Гранулоцит-макрофаг колонієстимулюючий фактор | FM-КСФ | МСР-1 | Моноцитарний хемотаксис пептид-1 | МХП-1 |
| IFN | Інтерферон | ІНФ | NK | Натуральний кілер | НК |
| IL | Інтерлейкін | ІЛ | |||
| IL 1 га | Антагоніст рецептора ІЛ-1 | АР ІЛ-1 | TGF-бета | Трансформуючий фактор росту бета | ТФР-бета |
| LPS | Ліполісахариди | лпс | TNF-альфа | Трансформуючий фактор зростання альфа | ТФР-альфа |
| LT | Лімфотоксин | лт |
У нормі продукція цитокінів незначна і призначена для підтримки взаємодії між клітинами, що продукують цитокіни, та клітинами, що виділяють інші медіатори запалення. Але вона різко зростає при запаленні у зв'язку з активацією клітин, які їх виробляють.
У початковій стадії розвитку запалення одночасно виділяються прозапальні та антизапальні інтерлейкіни. Пошкоджуюча дія прозапальних інтерлейкінів значною мірою нейтралізується протизапальними, в їхній продукції зберігається баланс. Антизапальні цитокіни мають корисну дію, вони сприяють обмеженню запалення, зменшенню загальної реакції на запалення, загоєнню рани.
Більшість реакцій при розвитку запалення здійснюється через посередництво цитокінів. Так, наприклад, ІЛ-1 активує Т-і В-лімфоцити, стимулює утворення С-реактивних білків ранньої фази запалення, продукцію прозапальних медіаторів (ІЛ-6, ІЛ-8, ФНП) та фактора активації тромбоцитів. Він збільшує прокоагулянтну активність ендотелію та активність адгезивних молекул на поверхні клітин ендотелію, лейкоцитів та тромбоцитів, викликає утворення мікротромбів у судинах мікроциркуляторного русла, викликає підвищення температури тіла.
ІЛ-2 стимулює Т-і В-лімфоцити, зростання NK-клітин, продукцію ФНП та інтерферону, збільшує проліферацію та цитотоксичні властивості Т-лімфоцитів.
ФНП має найбільш сильну прозапальну дію: стимулює секрецію прозапальних інтерлейкінів (ІЛ-1, ІЛ-6), виділення простагландинів, посилює активацію нейтрофілів, еозинофілів, моноцитів; активує комплемент та коагуляцію, збільшує молекулярну адгезію ендотелію лейкоцитів та тромбоцитів, внаслідок чого утворюються мікротромби у судинах мікроциркуляторного русла. При цьому підвищується проникність судинної стінки, порушується кровопостачання життєво важливих органів, у яких виникають осередки ішемії, що проявляється різними ознаками дисфункції внутрішніх органів.
Надмірна продукція цитокінів та інших медіаторів запалення викликає порушення регулюючої функції імунної системи, призводить до їх безконтрольного виділення, порушення балансу між прозапальними та антизапальними цитокінами на користь прозапальних. У зв'язку з цим медіатори запалення із факторів, що захищають організм, стають ушкоджуючими.
Монооксид азоту (N0) – потенційно токсичний газ.
Він синтезується з а-аргініну і переважно діє як інгібуючий нейротрансмітер. Оксид азоту синтезується як лейкоцитами, а й ендотелією судин.
Малі розміри цієї частки, відсутність електричного заряду та ліпофільність дозволяють їй легко проникати через мембрани клітин, брати участь у багатьох реакціях, змінювати властивості деяких білкових молекул. NO є найактивнішим із медіаторів запалення.
Оптимальний рівень N0 у крові необхідний підтримки нормального венозного тонусу і проникності судинної стінки. У мікроциркуляторному руслі. N0 захищає ендотелій судин (у тому числі печінки) від ушкоджуючої дії ендотоксинів та фактору некрозу пухлини.
Монооксид азоту стримує надмірну активацію макрофагів, тим самим сприяючи обмеженню синтезу надлишкової кількості цитокінів. Це послаблює ступінь порушення регулюючої ролі імунної системи в продукції цитокінів, сприяє збереженню балансу між про-запальними та антизапальними цитокінами, обмежує можливості медіаторів запалення викликати порушення функції паренхіматозних органів та розвиток синдрому системної реакції на запалення.
Монооксид азоту розслаблює м'язові клітини у стінках судин, бере участь у регуляції судинного тонусу, релаксації сфінктерів та проникності судинної стінки.
Надмірна продукція N0 під впливом цитокінів сприяє зниженню венозного тонусу, порушенню перфузії тканин, виникненню вогнищ ішемії в різних органах, що сприяє подальшій активації клітин, що продукують цитокіни та інші медитори запалення. Це збільшує тяжкість порушення функції імунної системи, порушує її здатність регулювати продукцію медіаторів запалення, призводить до збільшення вмісту їх у крові, прогресування синдрому системної реакції на запалення, зниження венозного тонусу, зменшення периферичного судинного опору, розвитку гіпотензії, депонування крові, розвитку , виникнення поліорганної дисфункції, що нерідко закінчується незворотною поліорганною недостатністю
Таким чином, дія NO може бути як ушкоджуючим, так і захисним по відношенню до тканин та органів.
Клінічні прояви синдрому системної реакції на запалення включають характерні йому ознаки: 1) підвищення температури тіла вище 38°З зниження її нижче 36°З анергії; 2) тахікардію - збільшення числа серцевих скорочень понад 90 за 1 хв; 3) тахіпное - збільшення частоти дихань понад 20 за 1 хв або зниження РаС0 2 менше 32 мм рт.ст.; 4) лейкоцитоз понад 12 10 3 в 1 мм 3 або зниження кількості лейкоцитів нижче 4 10 3 в 1 мм 3 або паличкоядерний зсув більш ніж на 10%
Тяжкість синдрому визначається кількістю наявних ознак порушення функцій органів у даного пацієнта. За наявності двох із чотирьох вищеописаних ознак синдром оцінюють як помірного (легкого) ступеня тяжкості, за трьох ознак - як середнього ступеня тяжкості, при чотирьох - як тяжкий. При виявленні трьох та чотирьох ознак синдрому системної відповіді на запалення ризик прогресування хвороби, розвитку поліорганної недостатності, що потребує спеціальних заходів для корекції, різко зростає.
Мікроорганізми, ендотоксини та локальні медіатори асептичного запалення зазвичай надходять із первинного вогнища інфекції або вогнищ асептичного запалення.
За відсутності первинного вогнища інфекції мікроорганізми та ендотоксини можуть надходити в кровотік з кишечника за рахунок т р а н с л о к а ц і через стінку кишки в кров або з первинно-стерильних вогнищ некрозу при гострому панкреатиті. Зазвичай це спостерігається при вираженій динамічній або механічній кишковій непрохідності, яка зумовлена гострими запальними захворюваннями органів черевної порожнини.
Легкий синдром системної відповіді на запалення - це насамперед сигнал про надмірну продукцію цитокінів надмірно активованими макрофагами та іншими цитокінпродукуючими клітинами.
Якщо вчасно не будуть вжиті заходи профілактики та лікування основного захворювання, синдром системної реакції на запалення буде безперервно прогресувати, а поліорганна дисфункція, що починається, може перейти в поліорганну недостатність, яка, як правило, є проявом генералізованої інфекції - сепсису.
Таким чином, синдром системної реакції на запалення - це початок патологічного процесу, що безперервно розвивається, є відображенням надлишкової, недостатньо контрольованої імунної системою секреції цитокінів та інших медіаторів запалення, внаслідок порушення міжклітинних взаємовідносин у відповідь на важкі антигенні стимули як бактеріальної, так і небактеріальної природи.
Синдром системної реакції на запалення, що виникає внаслідок важкої інфекції, не відрізняється від реакції, що виникає у відповідь на асептичне запалення при масивній травмі, гострому панкреатиті, травматичних хірургічних втручаннях, трансплантації органів, великих опіках. Це пов'язано з тим, що у розвитку даного синдрому беруть участь одні й самі патофізіологічні механізми і медіатори запалення.
Діагностика та лікування.Визначення та оцінка ступеня тяжкості синдрому системної реакції на запалення доступні будь-якому лікувальному медичному закладу. Цей термін прийнятий міжнародним співтовариством лікарів різних спеціальностей у більшості країн світу.
Знання патогенезу синдрому системної реакції на запалення дозволяє розробляти антицитокінову терапію, профілактику та лікування ускладнень. Для цього застосовують моноклональні антитіла проти цитокінів, антитіла проти найбільш активних прозапальних цитокінів (ІЛ-1, ІЛ-6, фактора некрозу пухлини). Є повідомлення про хорошу ефективність плазмофільтрації через спеціальні колонки, що дозволяють видаляти надлишок цитокінів із крові. Для пригнічення цитокінпродукуючої функції лейкоцитів та зниження концентрації цитокінів у крові застосовують (щоправда, не завжди успішно) великі дози стероїдних гормонів. Найважливіша роль лікуванні хворих належить своєчасному та адекватному лікуванню основного захворювання, комплексної профілактики та лікування дисфункції життєво важливих органів.
Частота синдрому системної відповіді на запалення у пацієнтів відділень інтенсивної терапії у хірургічних клініках досягає 50%. При цьому у хворих з високою температурою тіла (це одна з ознак синдрому), що знаходяться у відділенні інтенсивної терапії, синдром системної відповіді на запалення спостерігається у 95% хворих. Кооперативне дослідження, що охоплює кілька медичних центрів США, показало, що із загальної кількості хворих із синдромом системної реакцію запалення лише в 26% розвинувся сепсис і в 4%- септичний шок. Летальність зростала в залежності від ступеня тяжкості синдрому. При тяжкому синдромі системної відповіді на запалення вона становила 7%, при сепсисі – 16%, при септичному шоці – 46%.
Синдром системної реакції на запалення може тривати лише кілька днів, але він може існувати і протягом більш тривалого часу, до зменшення вмісту цитокінів та монооксиду азоту (N0) у крові, до відновлення балансу між прозапальними та антизапальними цитокінами, відновлення функції імунної системи контролювати продукцію цитокінів.
При зменшенні гіперцитокінемії симптоми можуть поступово йти на спад, у цих випадках небезпека розвитку ускладнень різко зменшується, найближчими днями можна розраховувати на одужання.
При тяжкій формі синдрому є пряма кореляція між вмістом цитокінів у крові та тяжкістю стану пацієнта. Про- та антизапальні медіатори можуть, нарешті, взаємно посилювати свою патофізіологічну дію, створюючи наростаючий імунологічний дисонанс. Саме за цих умов медіатори запалення починають надавати шкідливу дію на клітини та тканини організму.
Складна комплексна взаємодія цитокінів і цитокіннейтралізуючих молекул, ймовірно, визначає клінічні прояви та перебіг сепсису. Навіть важкий синдром системної відповіді на запалення не можна розглядати як сепсис, якщо пацієнт не має первинного вогнища інфекції (вхідних воріт), бактеріємії, підтвердженої виділенням бактерій з крові при багаторазових посівах.
Короткий екскурс в історію
Сучасний стан вчення про фагоцитоз
Макрофаги перитонеального ексудату як модель
фагоцитозу та порушень фагоцитарної активності
Отримання моделі
Методи реєстрації результатів
Деякі процеси, що моделюються
ЗНИЖЕННЯ БАКТЕРІАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ ПЕРИТОНЕАЛЬНИХ
МАКРОФАГІВ МИШЕЇ В УМОВАХ ПОЄДНАНОГО
ЗАСТОСУВАННЯ СТАФІЛОКОККОВОГО ЕНТЕРОТОКСИНУ ТИПУ А І ЕНДОТОКСИНУ
СКАСУВАННЯ ПІДСИЛЮЮЧОГО ФАГОЦИТОЗ ДІЇ ОПСОНІНІВ
ЗА ДОПОМОГОЮ ФРАГМЕНТІВ АНТИТЕЛ ПРОТИ Fc-РЕЦЕПТОРІВ МАКРОФАГІВ
ПОСИЛЕННЯ З ДОПОМОГЮ ХІТОЗАНУ РЕАКЦІЇ
КОНТАКТНОГО ВЗАЄМОДІЯ МАКРОФАГА З ТИМОЦИТАМИ in vitro
АКТИВАЦІЯ ФАГОЦИТАРНИХ КЛІТИН І КЛІТИННОГО
ІМУНІТЕТА СИНТЕТИЧНИМИ ПОЛІЕЛЕКТРОЛІТАМИ
ФАГОЦИТАРНА АКТИВНІСТЬ МАКРОФАГІВ
ПЕРИТОНЕАЛЬНОГО ЕКССУДАТУ МИШЕЙ ДІЇ ПРЕПАРАТІВ ПЛАТИНИ
ВИВЧЕННЯ ФАГОЦИТАРНОЇ АКТИВНОСТІ ПЕРИТОНЕАЛЬНИХ МАКРОФАГІВ
ВІДНОСИНИ YERSINIA PESTIS З ДЕФЕКТНИМИ І ПОВНОЦІННИМИ FRA-ГЕНАМИ
ВПЛИВ МОДИФІКАТОРІВ БІОЛОГІЧНОГО ВІДПОВІДЮ ПРИРОДНОГО
ПОХОДЖЕННЯ НА ФУНКЦІОНАЛЬНУ АКТИВНІСТЬ МАКРОФАГІВ
ПЕРИТОНЕАЛЬНІ МАКРОФАГИ ЯК МОДЕЛЬ
ДЛЯ ВИВЧЕННЯ АТЕРОГЕННОГО ПОТЕНЦІАЛУ СИВОРОТКИ КРОВІ
ВПЛИВ ГАМК, ГОМК І ГЛУТАМІНОВОЇ
КИСЛОТИ НА ФУНКЦІОНАЛЬНУ АКТИВНІСТЬ ФАГОЦИТІВ
Висновок
Деякі інші моделі вивчення фагоцитозу
Література
Короткий екскурс в історію
Понад 100 років минуло з відкриття фагоцитарної теорії, створеної нашим великим натуралістом, лауреатом Нобелівської премії І. І. Мечниковим. Відкриття, осмислення явища фагоцитозу і формулювання в загальних рисах основ фагоцитарної теорії було зроблено ним у грудні 1882 р. У 1883 р. він виклав основи нової фагоцитарної теорії в доповіді "Про цілющі сили організму" в Одесі на VII з'їзді у пресі. Були вперше висловлені основні положення фагоцитарної теорії, які І. І. Мечников розвивав надалі протягом усього свого життя. Хоча сам факт поглинання живими клітинами інших частинок був описаний багатьма натуралістами задовго до вченого, проте він дав блискуче тлумачення величезної ролі фагоцитів у захисті організму від хвороботворних мікробів.
Багато пізніше до 70-річного ювілею вченого колега та друг І. І. Мечникова Еміль Ру напише: “Сьогодні, мій друже, Ви спостерігаєте доктрину фагоцитозу зі спокійним задоволенням батька, дитя якого зробило гарну кар'єру у світі, але скільки занепокоєнь воно Вам завдало! Його поява викликала протести та опір і протягом двадцяти років Вам довелося битися за нього”. Доктрина фагоцитозу “...одна з найбільш плідних у біології: вона пов'язала явище імунітету із внутрішньоклітинним травленням, вона пояснила нам механізм запалення та атрофії; вона оживила патологічну анатомію, яка, не в змозі дати прийнятне пояснення, залишалася суто описовою... Ваша ерудиція така широка і вірна, що служить усьому світу”.
І. І. Мечников стверджував, що “...імунітет в інфекційних хворобах має бути приписаний до активної целюлярної діяльності. Серед клітинних елементів фагоцити мають посісти перше місце. Чутливість і рухливість, здатність поглинати тверді тіла та виробляти речовини, що можуть руйнувати та перетравлювати мікробів – ось головні фактори діяльності фагоцитів. Якщо ці властивості достатньо розвинені і паралізують патогенну дію мікробів, тоді тварина від природи імунна... коли фагоцити не виявляють наявності всіх або однієї з цих властивостей достатньою мірою, то тварина сприйнятлива до інфекції...”. Разом з тим, якщо бактеріальні продукти викликають у фагоцитів негативний хемотаксис або якщо при позитивному хемотаксисі фагоцити не поглинають бактерій або поглинають, але не вбивають їх, - також розвивається смертельна інфекція. Вирішення фундаментальних проблем порівняльної ембріології та біології, що призвело до найбільших відкриттів вченого, дозволило І. І. Мечникову встановити, що “фагоцитоз надзвичайно поширений у тваринному світі... як на найнижчому ступені тваринних сходів, наприклад, у найпростіших, так і. .у ссавців і людини... фагоцити є мезенхімальні клітини”.
І. І. Мечников був у той час першим, хто зайнявся порівняльним вивченням явища фагоцитозу. Увага вченого була звернена не лише на традиційні лабораторні об'єкти, а й на таких представників світу тварин, як дафнії, морські зірки, крокодили, мавпи. Порівняльне вивчення фагоцитозу було необхідно І. І. Мечникову для доказу загальності явищ поглинання і руйнування чужорідного матеріалу фагоцитуючи мононуклеарами, широкого поширення в природі форми імунологічного захисту, що вивчається ним.
Клітинна теорія Мечникова відразу натрапила на опір. Насамперед вона була запропонована в той час, коли більшість патологів бачили у запальній реакції, а також у пов'язаних з нею мікрофагах і макрофагах не захисну, а шкідливу реакцію. У той час вважали навіть, що хоча фагоцитуючі клітини дійсно здатні поглинати хвороботворні мікроорганізми, це призводить не до руйнування збудника, а до перенесення його в інші частини тіла і поширення хвороби. Також у період інтенсивно розвивалася гуморальна теорія імунітету, основи якої було закладено П.Эрлихом. Були відкриті антитіла та антигени, були виявлені механізми гуморальної стійкості організму проти деяких патогенних мікроорганізмів та їх токсинів (дифтерія, правець та ін.). Хоч як це дивно, але два такі відкриття не могли деякий час ужитися разом. Пізніше 1888 р. Наттолл знайшов у сироватці нормальних тварин речовини, токсичні деяких мікроорганізмів, і показав, що такі антибактеріальні властивості значно підвищуються внаслідок імунізації тварини. Надалі було виявлено, що в сироватці є дві різні речовини, спільна дія яких призводить до лізису бактерій: термостабільний фактор, потім ідентифікований як сироваткові антитіла, і термолабільний фактор, названий комплементом, або алексином (від грец. aleksein - захищати). Мечникова Борде описав лізис еритроцитів гуморальними антитілами та комплементом, і більшість дослідників почали погоджуватися з Кохом, що перемогу здобули гуморалісти. Мечников та його учні аж ніяк не збиралися здаватися. Були поставлені прості досліди, в яких мікроби, поміщені в маленький мішечок з фільтрувального паперу, що захищають від фагоцитів, зберігали свою вірулентність, хоча буквально купалися в тканинній рідині, багатій на антитіла. ВАнглії сер Елмрот Райт і С. Р. Дуглас спробували примирити відмінності між цими двома школамив своїх капітальних дослідженнях процесу опсонізації (від грец. opsonein -робити їстівним). Ці вчені стверджували, що клітинний і гуморальний фактори є однаково важливими і взаємозалежними в тому відношенні, що гуморальні антитіла, специфічно реагуючі зі своєю мішенню - мікроорганізмом, готують його до фагоцитозу макрофагами.
У 1908 р. Шведська академія удостоїла Нобелівської премії з медицини спільно Мечникова - засновника клітинного напряму та Ерліха - уособлював гуморалістські ідеї тогочасу. Вони були удостоєні премії як "визнання їх робіт з імунітету".
Заслуга Мечникова полягає у створенні ним геніальної теорії. Ще раніше він почав вивчати заразні хвороби людини та свійських тварин: разом зі своїм учнем Н. Ф. Гамалією він вивчав туберкульоз, чуму рогатої худоби, шукав способи боротьби зі шкідниками сільського господарства. До 1886 належить одна з найважливіших подій в історії російської медицини. Влітку цього року в Одесі почала працювати створена Мечниковим та його талановитим учнем Н. Ф. Гамалією перша російська бактеріологічна станція. Він створив у Росії найбільшу наукову школу мікробіологів. Видатні вчені Н. Ф. Гамалея, Д. К. Заболотний, Л. А. Тарасевич та багато інших були учнями І. І. Мечникова. Ілля Ілліч Мечников помер у 1916 році, до кінця життя займаючись питаннями імунології та клітинного імунітету. А наука про імунітет швидко та стрімко розвивалася. У цей час було дуже багато робіт і вчених, які вивчали чинники внутрішнього захисту організму.
Період із 1910 по 1940гг. був періодом серології. У цей час було сформульовано положення про специфічність та про те, що АТ є природними, високоваріабельними глобулінами. Велику роль тут відіграли роботи Ландштейнера, який дійшов висновку, що специфічність антитіл не є абсолютною.
З 1905 р. з'явилися роботи (Сarrel, Guthrie) з трансплантації органів. У 1930р. Ландштейнер відкриває групи крові. Роботами з фагоцитозу, бактеріофагії, вірусів, патогенезу чуми займається Амадей Боррель. Премію присуджено Ф. Макфарлейну Бернету (1899 - 1985) та Пітеру Медавару (1915 - Англія) "за відкриття набутої імунолотичної толерантності". Медавар показав, що відторгнення чужорідного шкірного трансплантата підпорядковується всім правилам імунологічної специфічності, й у основі його лежать такі самі механізми, як і під час захисту від бактеріальних і вірусних інфекцій. Наступна робота, яку він провів разом із низкою учнів, заклала міцну основу для розвитку трансплантаційної імунобіології, яка стала важливою науковою дисципліною та надалі забезпечила багато досягнень у галузі клінічної трансплантації органів. Бернет опублікував книгу "Освіта антитіл" (1941). Зі своїм колегою, Франком Феннером, Бернет стверджував, що здатність до імунологічних реакцій виникає на порівняно пізніх стадіях ембріонального розвитку і при цьому відбувається запам'ятовування існуючих маркерів свого антигенів, присутніх в даний момент. Організм у подальшому набуває до них толерантності і не здатний відповідати на них імунологічною реакцією. Усі антигени, які не запам'яталися, сприйматимуться як “не свої” і зможуть надалі викликати імунологічну відповідь. Було висловлено припущення, що будь-який антиген, введений протягом цього критичного періоду розвитку, буде сприйматися як свій і викликати толерантність, в результаті чого не зможе надалі активувати імунну систему. Ці ідеї були розвинені Бернетом у його клонально-селекційної теорії освіти антитіл. Припущення Бернета і Феннера були піддані експериментальній перевірці у дослідженнях Медавару, який у 1953 р. на мишах чистих ліній отримали чітке підтвердження гіпотези Бернета - Феннера, описавши феномен, якому Медавар дав назву набутої імунологічної толерантності.
У 1969р. одночасно кількома авторами (Р.Петров, М.Беренбаум, І.Ройт) була запропонована триклітинна схема кооперації імуноцитів в імунній відповіді (Т-, В-лімфоцитів та макрофагів), що визначила на багато років вивчення механізмів імунної відповіді, субпопуляційної організації клітин системи імун .
Істотну роль цих дослідженнях зіграли кінематографічні методи. Можливість безперервного динамічного вивчення мікробіологічних об'єктів in vivo та in vitro в умовах, сумісних з їх життєдіяльністю, візуалізація невидимих для людського ока електромагнітних випромінювань, реєстрація як швидких, так і повільних процесів, управління масштабом часу та деякі інші характерні особливості дослідницької кінематографії відкрили великі У багатьох відношеннях унікальні можливості для вивчення взаємодії клітин.
Уявлення про фагоцитах за минулий час зазнало суттєвої еволюції. У 1970 р. Van Furth та співавт. запропонували нову класифікацію, що виділяє МФ із РЕМ в окрему систему мононуклеарних фагоцитів. Дослідники віддали шану І. І. Мечникову, який користувався терміном "мононуклеарний фагоцит" ще на початку XX століття. Фагоцитарна теорія стала, проте, незмінною догмою. Безперервно накопичені наукою факти змінили й ускладнили розуміння явищ, у яких фагоцитоз здавався вирішальним чи єдиним чинником.
Можна стверджувати, що у наші дні створене І. І. Мечниковим вчення про фагоцитах переживає своє друге народження, нові факти значно збагатили його, показавши, як і передбачав Ілля Ілліч, величезне общебиологическое значення. Теорія І. І. Мечникова стала потужним індуктором прогресу імунології в усьому світі, великий внесок у нього зробили радянські вчені. Однак і сьогодні основні положення теорії залишаються непорушними.
Першорядне значення фагоцитарної системи підтверджується створенням у США суспільства вчених, які займаються вивченням ретикулоендотеліальної системи (РЕМ), видається спеціальний “Journal of Reticulo-Endothelial Society”.
У наступні роки розвиток фагоцитарної теорії пов'язаний з відкриттям цитокінової регуляції імунної відповіді та, звичайно, вивчення впливу цитокінів на клітинну відповідь у тому числі і макрофагів. На зорі цих відкриттів чи стояли роботи таких учених, як Н. Єрне,
Р. Келер, Ц. Мілштейн.
У СРСР бурхливий інтерес до фагоцитів та пов'язаних з ними процесами спостерігався у 80-ті роки. Тут слід зазначити роботи А.Н.Маянского, який вивчав впливу макрофагів у світлі їх імунної функції. Він показав значення клітин РЕМ на функціонування таких органів як печінка, легені, шлунково-кишковий тракт. Роботи також проводили О.Д. Адо, В.М.Земсков, В.Г.Галактіонов, експерименти з вивчення роботи МФ в осередку хронічного запалення ставив Сєров.
Слід сказати, що у 90-ті роки інтерес до неспецифічної ланці імунітету впав. Частково це можна пояснити тим, що всі зусилля вчених були в основному спрямовані до лімфоцитів, але особливо до цитокінів. Можна сказати, що зараз продовжується “цитокіновий бум”.
Однак це в жодному разі не означає, що актуальність проблеми впала. Фагоцитоз становить приклад того процесу, інтерес якого не може зникнути. Буде відкриття нових факторів, що стимулюють його активність, будуть виявлені речовини, що пригнічують РЕМ. Будуть відкриття, що уточнюють тонкі механізми взаємодії МФ з лімфоцитами, з інтерстиціями клітин, з антигенними структурами. Особливо це може бути актуальним зараз у зв'язку з проблемою пухлинного зростання та СНІДу. Залишається сподіватися, що у низці відкриттів, започаткованих великим Мечниковим, стоятимуть імена російських учених.
СУЧАСНИЙ СТАН ВЧЕННЯ ПРО ФАГОЦИТОЗ
Основні положення про фагоцити та систему фагоцитозу, блискуче сформульовані І. І. Мечниковим та розроблені його учнями та послідовниками, надовго визначили розвиток цього найважливішого напряму біології та медицини. Ідея про протиінфекційний імунітет, яка так захопила сучасників І. І. Мечникова, відіграла вирішальну роль у становленні клітинної імунології, еволюції поглядів на запалення, фізіологію та патологію реактивності та резистентності організму. Парадоксально і разом з тим закономірно, що вчення про фагоцитоз почалося з великих узагальнень і концепцій, які протягом багатьох років доповнювалися фактами приватного характеру, які мало вплинули на розвиток проблеми в цілому. Хвиля сучасної імунологічної інформації, достаток витончених методів та гіпотез направили інтереси багатьох дослідників у бік вивчення лімфоцитарних механізмів клітинного та гуморального імунітету. І якщо імунологи швидко зрозуміли, що без макрофагу їм не обійтися, то доля іншого класу клітин фагоциту - полінуклеарних (сегментоядерних) лейкоцитів - до недавнього часу залишалася неясною. Тільки тепер можна з упевненістю сказати, що і ця проблема, зробивши за останні 5-10 років якісний стрибок, міцно утвердилася та успішно розвивається не лише імунологами, а й представниками суміжних професій – фізіологами, патологами, біохіміками, клініцистами. Вивчення полінуклеарних фагоцитів (нейтрофілів) - один з небагатьох прикладів у цитофізіології, а тим більше в імунології, коли кількість досліджень на об'єкті "людського походження" перевищує кількість робіт, виконаних в експерименті на тваринах.
Сьогодні вчення про фагоцитоз - це сукупність уявлень про вільні та фіксовані клітини кістковомозкового походження, які, володіючи потужним цитотоксичним потенціалом, винятковою реактивністю та високою мобілізаційною готовністю, виступають у першій лінії ефекторних механізмів імунологічного гомеостазу. Протимікробна функція сприймається як приватний, хоч і важливий, епізод цієї загальної стратегії. Доведено потужні цитотоксичні потенції моно- та полінуклеарних фагоцитів, які, крім бактерицидності, виражаються у знищенні малігнізованих та інших форм патологічно змінених клітин, альтерації тканин при неспецифічному запаленні в імунопатологічних процесах. Якщо нейтрофіли (домінуючий тип полінуклеарів) майже завжди націлені на деструкцію, то функції мононуклеарних фагоцитів складніші та глибші. Вони беруть участь у руйнуванні, а й у творенні, запускаючи фібробластичні процеси і репаративні реакції, синтезуючи комплекс біологічно активних субстанцій (фактори комплементу, індуктори мієлопоезу, імунорегуляторні білки, фибронектини ін.). Справляється стратегічний прогноз І. І. Мечникова, який завжди дивився на фагоцитарні реакції із загальнофізіологічних позицій, стверджуючи значення фагоцитів у захисті від “шкідливих діячів”, а й у спільній боротьбі гомеостаз, що зводиться до підтримки відносного сталості внутрішнього середовища організму. "При імунітеті, атрофії, запаленні та лікуванні, у всіх явищах, що мають найбільше значення в патології, беруть участь фагоцити".
Мононуклеарні фагоцити, які раніше відносили до ретикулоендотеліальної системи, виділені в самостійне сімейство клітин - систему мононуклеарних фагоцитів, яка поєднує моноцити кісткового мозку та крові, вільні та фіксовані тканинні макрофаги. Доведено, що, виходячи з крові, моноцит змінюється, адаптуючись до умов того середовища, в яке потрапляє. Це забезпечує спеціалізацію клітини, тобто максимальну відповідність тим умовам, в яких вона має “працювати”. Не виключена й інша альтернатива. Подібність моноцитів може бути суто зовнішньою (як це сталося з лімфоцитами), і частина з них передетермінована до трансформації в різні варіанти макрофагів. Гетерогенність зрілих нейтрофілів хоч і існує, але виражена набагато слабше. Вони майже не змінюються морфологічно, потрапляючи в тканини, на відміну від макрофагів живуть там недовго (не більше 2-5 діб) і явно не мають пластичності, властивої моноцитам. Це високодиференційовані клітини, які практично закінчують свій розвиток у кістковому мозку. Не випадково відомі в минулому спроби відшукати кореляцію між сегментацією ядра і здатністю лейкоцитів до фагоцитозу не увінчалися успіхом. Проте ідея про функціональну неоднорідність морфологічно зрілих нейтрофілів продовжує отримувати підтвердження. Відомі відмінності між нейтрофілами кісткового мозку та периферичної крові, нейтрофілами крові, тканин та ексудатів. Причини та фізіологічний зміст цих особливостей невідомі. Очевидно, мінливість полінуклеарів на відміну моноцитов-макрофагов носить тактичний характер.
Вивчення фагоцитозу ведеться згідно з класичними постулатами І. І. Мечникова про фази фагоцитарної реакції - хемотаксису, атракції (зв'язування) та поглинання, знищення (перетравлення). До характеристики кожного з цих процесів нині прикута увага, їм присвячують монографії, огляди. Результати численних досліджень дозволили заглибитись у суть цих реакцій, конкретизувати молекулярні фактори, що лежать у їх основі, намацати загальні вузли та розкрити приватні механізми клітинної реактивності. Фагоцитоз служить чудовою моделлю для вивчення міграційної функції, просторової орієнтації клітин та їх органел, злиття та новоутворення мембран, регуляції клітинного гомеостазу та інших процесів. Іноді фагоцитоз нерідко ототожнюють із поглинанням. Це явно невдало, бо порушує уявлення, що історично склалося, про фагоцитоз як про інтегральний процес, який об'єднує суму клітинних реакцій, починаючи з розпізнавання об'єкта і закінчуючи його руйнуванням або прагненням до руйнування. З функціональної точки зору фагоцити можуть перебувати у двох станах - спокої та активованому. У найбільш загальному вигляді активація - є результатом перетворення зовнішнього стимулу в реакцію ефекторних органел. Більше пишуть про активований макрофаг, хоча в принципі те саме можна зробити і для полінуклеарів. Треба вибрати лише точку відліку - наприклад, функціональний статус судинному руслі нормального організму. Активація відрізняється як ступенем порушення індивідуальних клітин, а й масштабом охоплення клітинної популяції загалом. У нормі активована невелика кількість фагоцитів. Поява подразника різко змінює цей показник, відбиваючи підключення фагоцитів до реакцій, котрі коригують внутрішнє середовище організму. Прагнення проактивувати фагоцитарну систему, посиливши цим її ефекторні можливості, неодноразово звучало на роботах І. І. Мечникова. Сучасні дослідження з ад'ювантів, біологічних та фармакологічних модуляторів мононуклеарних та полінуклеарних фагоцитів по суті розвивають цю думку з позицій міжклітинної кооперації, загальної та приватної патології. У цьому бачиться перспектива раціонального впливу на запалення, репаративні та регенеративні процеси, імунопатологію, резистентність до гострого та хронічного стресу, стійкість до інфекцій, пухлин та ін.
Багато ознак активації стереотипні, повторюючись у всіх фагоцитуючих клітин. До них відносяться зміна активності лізосомальних та мембранних ферментів, посилення енергетичного та окисного метаболізму, синтетичних та секреторних процесів, зміна адгезивних властивостей та рецепторної функції плазматичної мембрани, здатності до випадкової міграції та хемотаксису, поглинання та цитотоксичності. Якщо врахувати, що з цих реакцій за своєю природою інтегративна, кількість приватних ознак, якими можна будувати висновки про порушення клітин, буде величезним.
Один і той же подразник здатний індукувати всі чи більшість ознак активації. Однак це швидше виняток, ніж правило. Сьогодні багато відомо про конкретні механізми, що реалізують ефекторні властивості моно та полінуклеарних фагоцитів. Розшифровано структурну основу рухових реакцій, відкрито органели, що забезпечують векторну орієнтацію у просторі, вивчені закономірності та кінетика утворення фаголізосом, встановлено природу цитотоксичності та бактерицидності, визначено синтетичні та секреторні потенції, виявлено рецепторні та каталітичні процеси у плазмі. що дискретні прояви клітинної реактивності забезпечуються або, принаймні, ініціюються відокремленими механізмами і можуть виникати незалежно один від одного. Вдається придушити або посилити хемотаксис, не змінивши здатності до поглинання і цитотоксичності, секреція не пов'язана з поглинанням, підвищення адгезивності не залежить від споживання кисню і т. д. Відомі генетичні дефекти, коли випадає одна або кілька з перерахованих функцій, причому багато з них з клінічної симптоматики. Якщо до цього додати патологію медіаторних систем, що генерують хемоатрактанти та опсоніни, стане зрозуміло, наскільки складним і одночасно конкретним має бути сьогодні діагноз, який констатує порушення фагоцитозу.
Великою подією стало утвердження молекулярних основ цитотоксичності (зокрема бактерицидності) та її ставлення до реактивності клітин. Прагнення зрозуміти сутність реакцій, що призводять до загибелі поглинених бактерій, проглядає у більшості робіт І. І. Мечникова. Багато років ця проблема традиційно зводилася до "перетравлення", в якому беруть участь гідролітичні ферменти (цитази, за І. І. Мечникова), що визначають, як вважали, антимікробні властивості фагоцитів. Ця позиція була сильно похитнулася, після того, як виявилося, що лізосомальні гідролази мають слабку бактерицидність in vitro або позбавлені її. В основу сучасних поглядів покладено спостереження, що свідчать про посилення окисного метаболізму активованих фагоцитів та роз'єднання двох головних подій - кілінг-ефекту та деградації вбитих, нежиттєздатних об'єктів. Колишня термінологія, в якій закріплено причинний зв'язок між знищенням живої мішені і функцією клітини, що перетравлює, залишена. Перетравлення, яке зумовлене кислими та нейтральними гідролазами, преформованими в гранулах, є вторинним та націлене на об'єкти, вбиті залежними та незалежними від кисню механізмами - біооксидантами, системою мієлопероксидази, катіонними білками, лактоферином, лізоцимом. Реалізація цитотоксичності відбиває реактивне збудження фагоцитуючих клітин, які секретують эффекторные молекули всередину фагосом (з утворенням фаголізосом) чи назовні, атакуючи позаклітинні (непоглинені) об'єкти. Те, що кількість кисню, що поглинається лейкоцитами, значно збільшується при фагоцитозі, відомо давно. Проте справжнє значення цього феномена, що у сучасній літературі часто називають респіраторним, чи метаболічним, вибухом, осмислено лише останні роки. На відміну від багатьох клітин кисневе дихання не є системою життєзабезпечення фагоцитів – вони добре переносять гіпоксію та виконують низку функцій в умовах анаеробіозу. За допомогою респіраторного вибуху моноцити-макрофаги та нейтрофіли вирішують суто ефекторні завдання, "озброюючись" проти мікробів та інших об'єктів, які сприймаються ними як антигомеостатичні фактори. В анаеробному середовищі фагоцити зберігають здатність до поглинання, але різко знижують токсичність щодо багатьох патогенних та умовно-патогенних бактерій. Ключовий механізм зводиться до активації мембранних оксидаз, що каталізують перенесення електронів з НАДФН на молекулярний кисень. Це стимулює окислення глюкози в гексозомонофосфатному шунті, що призводить до гіперпродукції перекису водню та вільних радикалів кисню – біологічних оксидантів із потужними цитотоксичними потенціями. Клінічне значення подібних реакцій стало очевидним після того, як було виявлено фатальне зниження протиінфекційного імунітету у дітей із вродженою патологією системи респіраторного вибуху нейтрофілів. Втім, було б неправильно протиставляти різні антимікробні чинники. Їх ефективність багато в чому залежить від взаємної збалансованості умов, у яких відбувається фагоцитоз, вид мікроба. Нейтрофіли, позбавлені можливості використовувати бактерицидні властивості активованого кисню, проте нормально вбивають епідермальний стафілокок, синьогнійну паличку, зелений стрептокок, облігатні анаероби. Відносна стійкість до фагоцитозу визначається сумою ознак – поверхневими властивостями мікробної клітини, наявністю факторів типу лейкотоксинів та антифагінів, інактивацією біооксидантів та ін. Давно виявлено здатність деяких бактерій гальмувати утворення фаголізосом. Цей механізм, який унеможливлює контакт з цитотоксичними компонентами фагоцитів, забезпечує тривале персистування в макрофагах туберкульозної палички, а в нейтрофілах - бруцел, а також інших мікроорганізмів. Одну з причин вбачають у підвищенні внутрішньоклітинного рівня циклічного аденозинмонофосфату, що блокує мобілізацію гранул та їх злиття з фагосомами. Цей приклад показує, наскільки глибокими можуть бути взаємини, що складаються у процесі фагоцитозу.
Становлення поглядів на механізми цитотоксичності фагоцитів не підірвало мечниковської концепції про цитази як про медіаторів, які опосередковують деструктивні функції клітин. І. І. Мечников неодноразово підкреслював, що, крім руйнації мікробів, фагоцити здатні пошкоджувати власні тканини. Ці ідеї отримали блискучий розвиток у сучасних роботах з ферментології лізосомальних гранул та способів їх підключення до фагоцитарних реакцій. У гранулах моно- і полінуклеарних фагоцитів ідентифікований великий арсенал гідролітичних ферментів (нейтральних і кислих гідролаз), кожному з яких можна знайти мета у позаклітинному просторі. Під їх прицілом знаходяться колагенові та еластинові волокна, пептидоглікановий матрикс хряща, фібронектин, фактори комплементу, системи калікреїн-кінінів, згортання, фібрино-лізу, імуноглобуліни, клітинні мембрани. На противагу старим уявленням сьогодні зроблено акцент на активному секреторному вивільненні ефекторних молекул, що значно підвищує ефекторну пластичність клітини, дозволяючи в найкоротший термін мобілізувати та раціонально використовувати свої можливості у фізіологічних ситуаціях та в ході різноманітних патологічних процесів. Секретуючи, фагоцити впливають інші медіаторні системи та руйнують позаклітинні об'єкти, розмір яких виключає можливість поглинання. Так, мабуть, справа при емфіземі легень, в реакціях на імунні комплекси, при гострому і хронічному запаленні. Кроме гидролаз и других компонентов лизосомальных гранул, активированные фагоциты выделяют пирогены, интерфероны и интерфероноподобные вещества, простагландины, тромбоксаны, биооксиданты, монокины, факторы, стимулирующие предшественники миелопоэза и пр. Лейкотриены вызывают сокращение гладких мышц и повышение сосудистой проницаемости, действуя в 100- 10000 раз сильніше, ніж гістамін.
Мав рацію І. І. Мечников, коли говорив про широкий спектр завдань, розв'язуваних фагоцитами, і різноманіття їх функціональних контактів (“живий ланцюга”, за І. І. Мечниковим) з іншими клітинами та тканинами. Активовані макрофаги і нейтрофіли є одним із найяскравіших прикладів екстреної мобілізації ефекторних механізмів з великою сферою застосування в масштабі не тільки сполучної тканини, але й всього організму.
Активатори моноцитів-макрофагів та полінуклеарів утворюються у системах комплементу, згортання, фібринолізу, калікреїн-кінінів, імуноглобулінів, виділяються лімфоцитами, фібробластами, тромбоцитами, ендотелією. Складні взаємини складаються і всередині самої фагоцитарної системи. Моноцитарний інфільтрат при запаленні формується під впливом хемоаттрактантів, що продукуються нейтрофілами, які першими мігрують до зони альтерації. У свою чергу моноцити та макрофаги виділяють фактори, що вибірково активують нейтрофіли. Істотне значення має функціональна кооперація між однотипними фагоцитами, яка передбачає участь “аутокаталітичних” механізмів, які контролюють міграційну, секреторну та інші функції активованих клітин. Ліпоксигеназні метаболіти арахідонової кислоти - різні варіанти гідроксиейкозантетраєнові кислоти хемотаксичні в нікчемних дозах (особливо для нейтрофілів) і, будучи потенційними "уламками" клітинного метаболізму уніфікують сигнали, які забезпечують спрямовану міграцію фагоцитів в оча. Будь-яка травма будь-якої тканини може стати ініціатором таких реакцій. У цьому вся простежується одне із універсальних механізмів гомеостазу - всередині популяції фагоцитів, у масштабі сполучної тканини, її межами.
Зі сказаного випливає важливий висновок. Важко підшукати таку зміну внутрішнього середовища організму, яка б не фіксувалася системою фагоцитозу. Будучи сильними эффекторами, фагоцити перетворюються на вузол зв'язку, свого роду стратегічну мету, якою трансформуються всі реакції крові та сполучної тканини. Особливо показовими є нейтрофіли. Обмінюючись у циркуляції кожні 5 год, вони фотографують зрушення, які відбуваються протягом цього періоду, будучи своєрідним дзеркалом гомеостазу. Невипадково, що індикаторні тести, засновані на високій реактивності полінуклеарів, давно використовують у клініці і з інформативності нерідко перевершують інші гематологічні показники.
Багато уваги приділяється молекулярним механізмам активації фагоцитів. Відповідно до загальних принципів сучасної цитофізіології схема фагоцитарної реакції передбачає розпізнавання та рецепцію (зв'язування) зовнішнього сигналу, реактивні зміни у плазматичній мембрані, активацію внутрішньоклітинних сигналів-посередників, функціональну трансформацію ефекторних органел. Відкриття стимуляторів з відомою структурою призвело до висновку, що їх вплив на фагоцити опосередковується через дискретні ділянки плазматичної мембрани - специфічні рецептори, які за молекулярною конфігурацією комплементарні стимулюючому агенту. Це визначає найважливішу властивість плазматичної мембрани - диференціювати молекулярний профіль зовнішніх подразників та трансформувати його у певну форму клітинної відповіді. Макрофаги та нейтрофіли рецептують Fc-фрагмент IgG- та IgA-імуноглобулінів, похідні комплементу (СЗЬ, C3d, СЗе, С5а, С567), різні хемоаттрактанти, пектини, бактеріальні глікопротеїди, фібронектин, адрен- та ерен-і пр. Разом вони визначають фармакологічний профіль,
тобто реактивність клітини до відповідного набору функціональних модуляторів. З'ясовується, що рецепторний апарат – дуже динамічна система. Маючи певний стартовий рівень, вона змінюється залежно від конкретної обстановки та стану клітин. Інтенсивність специфічної рецепції є однією з найцікавіших форм реактивності, управління якої дозволить впливати на ранні етапи фагоцитарного процесу. Принципово, що експресія різних рецепторів змінюється несинхронно, диференціюється фармакологічними агентами та призводить до неоднакових функціональних наслідків. Пасивна за суто зовнішніми ознаками (наприклад, хемоаттрактанти зв'язуються зруйнованими клітинами) рецепція супроводжується молекулярними зрушеннями в плазматичної мембрані, багато з яких грають ключову роль активації клітини. Один із постулатів сучасної цитофізіології, що стверджує функціональну або навіть структурну єдність рецепторів і ферментів плазматичної мембрани (ектоферментів), знайшов відображення і в дослідженнях фагоцитозу. У складі плазматичної мембрани фагоцитів виявлені серінестерази, протеїнази, аденілатциклази, оксидази, АТФ-ази. Вважають, що вони активуються при стимуляції, сприймаючи зміни молекулярної топографії клітинної поверхні. Ферментологія плазматичної мембрани відображає прагнення зрозуміти механізми, що ініціюють перемикання енергії подразнення в енергію клітинного збудження. Пошуки універсального ферменту-ініціатора не виправдалися, що, швидше, говорить про специфіку різних форм клітинної реактивності, ніж заперечує саму ідею ектоферменту. Не увінчалися успіхом і пошуки універсальної медіаторної ланки між реакціями плазматичної мембрани та ефекторними органелами. Цю роль претендували циклічні нуклеотиди, Са2+, похідні активованого кисню. Кожен з них контролює більш менш складний набір клітинних функцій, але в цілому їх ефект неуніверсальний. Навпаки, є факти, які переконують, що внутрішньоклітинне опосередкування може бути полідетермінантним, тобто залежить від спільної дії кількох медіаторів. Саме таке поєднання визначає кінцеву форму відповіді та властиво більшості фагоцитарних реакцій. За останніми даними, механізми, що забезпечують вихід на ті самі органели, можуть бути неоднакові для різних стимуляторів. Глибокий розвиток отримали ідеї І. І. Мечникова та його сучасників про опсонінах, які зіграли колись вирішальну роль об'єднанні клітинних і гуморальних концепцій імунітету. Поняття про опсонінах сформульовано 1903 р., а посилення фагоцитозу в сироватковому середовищі помічено ще раніше. Однак лише останні десятиліття ознаменувалося радикальними успіхами у вивченні молекулярних основ опсонічної функції та її реалізації лише на рівні клітин-ефекторів. До сімейства опсонінів зазвичай відносять чотири групи добре охарактеризованих сироваткових білків - IgG, СЗ (СЗЬ), фібронектин, С-реактивний білок, проте насправді їх, очевидно, більше. Найбільш універсальними властивостями мають СЗЬ-і IgG-антитіла. Кооперуючись один з одним, вони створюють потужний опсонічний заслін, який традиційно вважається одним із головних факторів протиінфекційного імунітету. Функції інших опсонінів, мабуть, більш обмежені, їх активність сильніше залежить від властивостей об'єкта, що фагоцитується, і типу фагоцитів. Саме неоднорідність субстратів, з якими доводиться стикатися фагоцитуючим клітинам, слід вважати першопричиною еволюційно закріпленої гетерогенності опсонічних факторів.
Важливим є питання про ставлення фагоцитозу до набутого (специфічного) імунітету. Класичний постулат І. І. Мечникова про перетравлення антигенного матеріалу фагоцитами як необхідний етап утворення антитіл трансформувався в сучасну концепцію про пред'явлення антигенних детермінант Т-лімфоцитів у вигляді комплексу з продуктами імунорегуляторних генів (Ia-білками), премованих на плазматичній мембрані макрофагів. Разом із медіаторами типу інтерлейкінів це визначає центральну позицію мононуклеарних фагоцитів у механізмах формування набутого імунітету. Для нейтрофілів не вдалося досягти більшого, ніж факту слабкого посилення проліферації В-лімфоцитів нейтральними протеїназами нейтрофілів людини та негативного впливу надлишку нейтрофілів на аналогічний феномен. Найімовірніше, це “пробіркові” реакції, які мають серйозного застосування до регуляції лімфоцитарних функцій in vivo. Інакше справа
лише на рівні ефекторного ланки імунних процесів. По суті, жодний із проявів набутого імунітету не відтворюється в повному обсязі без участі моноцитів-макрофагів та (або) полінуклеарів. Про це говорять реакції, наведені антитілами-опсонінами, гіперчутливість уповільненого типу, ушкодження, викликані імунними комплексами та ін.
Залежить від МФ відповідь лімфоцитів на неспецифічні мітогени - фітогемагглютинін, конканавалін А, перійодат, як і продукція ними лімфокінів - МІФ, МАФ, лімфотоксину та ін. Припускають, що активація Т-лімфоцитів здійснюється безпосередньо міф , що трансформує Т-клітини. МФ, виділяючи різні фактори, регулюють проліферацію та диференціювання незрілих кістковомозкових МФ, програнулоцитів, можливо, еритроїдних клітин. Вдалося виявити генетично зумовлені відмінності регулюючого впливу МФ на проліферативну активність стовбурових кровотворних клітин. Макрофаги також за допомогою різних розчинних факторів посилюють проліферацію фібробластів, епідермальних клітин шкіри, ендотелію судин, беруть участь у дозріванні клітин тимусу.
Сьогодні не може бути повністю прийнята гіпотеза про центральну роль тимусу і Т-клітин у протипухлинному нагляді, оскільки є відомості про однакову частоту виникнення пухлин у безтимусних і нормальних тварин, однакове їх відторгнення у імунодефіцитних або супресованих тварин, обмежену кількість пухлин у людей з тяжкою імуносупресією. На думку дослідників, роль Т-лімфоцитів досить однозначна у відторгненні вірусіндукованих пухлин, але вона невелика при спонтанних та індукованих канцерогенами неоплазмах. Цілий ряд доказів свідчить про складну систему природного та набутого антипухлинного захисту організму та обмежену роль у ній Т-лімфоцитів. Про це говорить ранній розвиток природної резистентності до пухлин протягом декількох днів після народження, придушення її при введенні речовин, що пригнічують МФ, безпосередньо перед трансплантацією пухлини або одночасно з нею, збіг індукованої стимуляції резистентності до пухлин з активуванням МФ. Тому все більшого значення в цій системі надають МФ. Виявилося, що неактивовані МФ не мають антипухлинну дію, але положення змінюється при активації клітин, яка може бути специфічною та неспецифічною. Специфічна активація виникає у клітин, взятих з імунного організму або інтактних МФ, інкубованих з імунними Т-лімфоцитами, з цими лімфоцитами і АГ або з продуктами реакції. МФ у цьому випадку активуються специфічним армуючим фактором, специфічно дізнаються та вбивають пухлину в результаті цитолізису. Неспецифічна активація обумовлена інфекційним процесом, ендотоксинами, ліпідом А, полінуклеотидами, імунними комплексами іншої специфічності. Активовані таким шляхом МФ набувають цитостатичних властивостей. МФ можуть армуватися специфічним до даних лімфоцитів фактором іншої специфічності на відміну фактора, індукованого пухлинними АГ, в такому випадку вони стають неспецифічно цитотоксичними по відношенню до пухлини. Тому, якщо до імунних МФ додати специфічні клітини пухлини, а потім через деякий час неспецифічні, МФ специфічно лізуватимуть гомологічну мішень і неспецифічно пригнічувати неспоріднену.
Таким чином, МФ в організмі швидше за все виявляють одночасно специфічну та неспецифічну клітинну цитотоксичність, виявляючи у першому випадку цитолітичні, а у другому – цитостатичні потенції.
Активовані МФ пригнічують проліферацію нормальних та пухлинних сінгенних, ало-генних і ксеногенних клітин - швидко проліферуючих сильніше, ніж повільно проліферуючих. Однак пухлинні клітини, що швидко проліферують, повністю пригнічуються, тоді як нормальні клітини - лише частково.
Механізм цитотоксичності МФ складний. Специфічний армуючий фактор із молекулярною масою 25000-50000 дальтон має афінність до АГ пухлини, зв'язується з поверхнею МФ, секретується комітованими Т-лімфоцитами. Важливим є міжклітинний контакт мішені та МФ, який постійно виникає, причому зона контакту має 100-200А. Припускають, що може сприяти локальному злиттю і ін'єктуванню в ціль лизосом МФ, лизирующих її. За різними даними, кілінг може здійснюватися сериновими протеазами, що виникають під впливом лізосомальних гідролаз СЗа-субкомпонентом комплементу, катіонним білком або індукцією макрофагами в цілях аберантного поділу, що призводить до їх лізису. Разом з тим вважають, що роль простагландинів, аргінази, перекису водню та інтерферону не така істотна в безпосередньому цитолітичному ефекті.
Певне значення надають зміні структури мембран ефекторів і мішеней, оскільки обробка МФ фосфоліпазою або лізолецетином індукує в них протипухлинну цитотоксичність, що пояснили можливим утворенням на мембрані цитолітичної структури внаслідок зміни її конформації. Подібні процеси, мабуть, відбуваються при активації МФ ліпополісахаридами (ЛПС), в результаті якої ЛПС через ліпід А зв'язується з плазматичною мембраною М.Ф, змінюючи її організацію в результаті формування комплексу ліпід А - мембранний ліпід, з цієї ж причини, можливо , тумороцидна здатність МФ різко пригнічувалася після їхньої експозиції з ліпопротеїдами низької щільності або холестериновими ліпосомами.
В організмі в силу постійного виділення бактеріальних ендотоксинів, імунологічних реакцій різної специфічності, що супроводжуються звільненням лімфокінів, утворенням імунних комплексів, постійно підтримується популяція неспецифічно активованих МФ, що виконують нагляд за трансформованими клітинами, що спонтанно з'являються, і елімініру.
МФ мають величезне значення системи мононуклеарних фагоцитів у природній стійкості організму до пухлин. Оскільки пригнічення проліферації макрофагами не залежить від виду та типу клітин, характеристики росту, трансформації та реактивності, це свідчить про наявність у МФ структур впізнавання, що не мають імунологічної специфічності. У цілях виникають загальні зміни, відомі всюдисущими МФ, які тому є широкими регуляторами загального клітинного гомеостазу.
За 120 років, що минули з дня створення І. І. Мечниковим вчення про фагоцити, воно пішло далеко вперед. Роль МФ виявилася набагато більш широкою і вийшла за рамки імунології.
Ця теорія справила глибоке конструктивне впливом геть увесь розвиток сучасної імунології. Саме вона стала початком вивчення клітинних аспектів імунітету. Деякі аспекти теорії, передбачені І. І. Мечниковим, досі залишаються недостатньо розробленими. Очевидно, що наукова спадщина, яку ми залишаємо І. І. Мечниковим, і в майбутньому визначатиме основні напрямки вчення про фагоцити.
Макрофаги перитонеального ексудату як модель фагоцитозу та порушень фагоцитарної активності.
В людини фагоцитуючу функцію виконують кілька типів клітин. Насамперед, це ті клітини, які здійснюють захист при будь-яких інфекціях та інвазіях – макрофаги, моноцити та нейтрофіли. Найменшою мірою вона представлена у еозинофілів та базофілів. Крім того, загальновідомим є той факт, що в різних тканинах функцію, що фагоцитує, беруть на себе (крім всюдисущих макрофагів) специфічні клітинні елементи даної тканини, наприклад: фіброкласти, остеокласти, клітини мікроглії. Також не можна забувати про те, що до тих важливих клітин, завдяки яким йде специфічна імунна відповідь, відносяться дендритні клітини, широко представлені в місцях, які є бар'єрними в організмі. І хоча їхня фагоцитуюча функція до кінця не доведена, дані про те, що це так, є.
Існують різні методи вивчення фагоцитуючої активності клітин, перерахованих вище. У цьому рефераті будуть розглянуті методи вивчення тих фагоцитів, які мають фагоцитирующая функція найбільш виражена і які становлять виняткову важливість в імунної системі людини, які патологія носить важкий характер. Йдеться про макрофаги (МФ). Вони добре піддаються вивченню in vivoі in vitro, культивування; моделювання різних процесів цих клітинах набуло широкого поширення і дало хороші результати. Це зумовлено їх великими розмірами, найширшою поширеністю в організмі, активністю метаболічних процесів, які у них, різноманітністю функцій, ними покладених.
Як модель, що добре себе зарекомендувала і найчастіше використовується в дослідах з вивчення фагоцитів, можна розглянути модель перитонеальних макрофагів in vitro.Широке поширення дана модель набула з кількох причин. По-перше, вона легко відтворюється. По-друге, вона дозволяє легко реєструвати результати досліджень. По-третє, цю модель можна отримати як у лабораторних тварин (щури, миші, морські свинки), так і в людини. По-четверте, при проведенні дослідів на тваринах можна використовувати різні лінії тварин (в т.ч. нокаут-тварин) і тварин з набутими (штучно викликаними) дефектами імунітету. По-п'яте, при постановці дослідів можна індукувати септичне та асептичне запалення, можна перед взяттям клітин провести різні впливи, а на моделі лише зареєструвати результати (тобто сама реакція проходить in vivo).
Можна наводити також інші причини, але обмежимося цими. Звичайно, ця модель не є єдиною, запропоновані й інші, про які буде згадано нижче.
Отже, розгляд обраної моделі відбуватиметься так:
- Варіанти отримання моделі.
- Можливі методи реєстрації результатів дослідження.
- Різні варіанти моделюваних процесів.
Питання, що стосуються практичного аспекту використання результатів дослідження, розглядатимуться у кожному випадку, а не виносяться в окремий розділ.
I. Отримання моделі.
Досліди проводять на білих мишах, щурах, морських свинках (поодиноких випадках на кроликах) різних ліній (CC57/W, CBA, “WISTAR”, C57BL/6), а також на нелінійних тварин. Виділяють індуковані та неіндуковані МФ. У разі, якщо необхідні інтактні МФ, то тваринам вводять інтраперитонеально стерильний 10% розчин пептону або кілька мл стерильного парафінової олії, також можна використовувати 2,5% розчин крохмалю у фіз. розчині. Зазвичай через 48 годин наркотизовану тварину забивають, перитонеальну порожнину промивають і перитонеальну рідину відсмоктують. В отриману рідину додають стабілізатор (гепарин, глютатіон) та антибіотики (але не макролідового ряду!), частіше використовують пеніцилін, стрептоміцин. Далі рідину можна центрифугувати і наступною витримкою, а можна одразу витримувати у скляних кюветах (2 год). Основний принцип полягає в тому, що макрофаги мають здатність прикріплюватися до скла або пластику, тоді як інші клітини цієї здатності не мають. Після експозиції саме середовище зливають (або промивають) і готують нову гепарин, що не містить. Отримана таким чином популяція клітин вважається, що складається на 95% МФ. Далі клітини поміщають на спеціальні середовища (N199) з поживними речовинами та антибіотиками. Зберігатися такі МФ можуть не більше 48-72 годин за підтримки оптимальної температури (37 С) та іонно-осмотичного балансу.
Якщо необхідні активовані МФ, то їх активацію проводять шляхом
- Імунізації тварини введенням різних сироваток або потужних антигенів,
- Індукуванням осередку септичного запалення очеревини (введення токсину в розчині пептону, введення суспензії вбитих або живих мікроорганізмів).
Подальші дії збігаються з названими.
Цікавим є також виділення людських МФ. Зазвичай їх отримують з асцитичної рідини хворих з недостатністю кровообігу III ступеня. Потім їх беруть в облогу центрифугуванням (400g, 10 хв), заморожують при температурі рідкого азоту. Після розморожування їх поміщають у спеціальні чашки із середовищем та культивують.
Іноді безпосередньо МФ отримані з перитонеального ексудату служать лише реєстрації досвіду поставленого над твариною in vivoта їх культивування носить лише діагностичний характер.
II.Реєстрація результатів
Після постановки дослідів виникає резонне питання, а як виявити зміну активності МФ, як визначити ті зміни, що вплинули на роботу клітин, що фагоцитують. У нашій країні найширше використовується кілька методів.
- Для дослідження поглинальної фази фагоцитозу використовують різноманітні тест-об'єкти. Ними можуть служити крім мікробів еритроцити та різні індиферентні частинки: латексу, туші, карміну, колоїдного вугілля, кадмію. Поглинальну активність фагоцитів оцінюють прямим візуальним підрахунком поглинених мікробів або інших частинок усередині МФ, а також за кількістю частинок, що залишилися непоглиненими, наприклад частинок латексу, за допомогою електронного лічильника частинок, еритроцитів по концентрації гемоглобіну спектрофотометрично, емульгованих соц мікрококів за допомогою флюориметра. Висока точність і продуктивність характеризують метод вивчення фагоцитозу флюоресцентних частинок латексу за допомогою автоматичного проточного цитофлюо-риметра. При використанні прямого візуального методу розраховують фагоцитарний індекс (ФІ) - відсоток клітин фагоциту від загального числа, фагоцитарне число (ФЛ) - середня кількість частинок, захоплених однією клітиною. Окремо враховують результати через 1 і 3 год: відповідно ФІ1, ФІ3, ФЧ1 і ФЧ3 і коефіцієнт фагоцитарного числа (КФЧ): відношення ФЧ1 до ФЧ3 - показник, що характеризує швидкість фагоцитозу.
- Оцінка хемотаксису лейкоцитів здійснюється двома найпоширенішими методами. Метод Бойдена заснований на принципі проходження лейкоцитів з однієї половини камери зі суспензією клітин в іншу половину з хемоатрактантом, розділених між собою мембранним фільтром. Для вивчення хемотаксису макрофагів застосовують фільтри з розміром пір відповідно 5-8 мкм. Існуючі різновиди методу Бойдена включають двофільтровий та радіоізотопний варіанти. Інший метод заснований на хемотаксисі під шаром агарози. Як хемоатрактант частіше використовують оброблену зимозаном або ліпополісахаридом сироватку, казеїн, фільтрат культури Е. coli або інших мікроорганізмів, синтетичні формілпептиди.
- Для оцінки рівня активності МФ використовується полярографічний метод (споживання кисню), НСТ-тест (відновлення нітросиного тетразолію), йодування (перехід радіоактивного міченого йоду в кислотонерозчинний осад), окиснення глюкози (утворення молекул 14СО2 при окисненні глюкози-1). Дані тести засновані на тому, що активація МФ супроводжується киснезалежним метаболічним "вибухом". Класичним із даних методів став НТС-тест. Справа в тому, що активовані фагоцити здатні поглинати нітросиній тетразолій (НСТ) і відновлювати його формазан. НСТ-тест дозволяє диференціювати активовані та інтактні фагоцити, але його не можна вважати кількісним, оскільки візуальна оцінка результатів суб'єктивна
- Також визначення бактерицидної здатності МФ використовується хемолюмінесцентний метод, запропонований порівняно недавно. Як відомо, фагоцитоз нейтрофілами та макрофагами супроводжується генерацією активних форм кисню (О2-, Н2О2, ОН-), що індукують явище хемілюмінесценції. Остання пропорційна інтенсивності генерації фагоцитами активних форм кисню і може бути непрямим критерієм їх фагоцитарної здатності, тим більше що продукти, що утворюються, мають виражені бактерицидні властивості. Метод аналізу хемілюмінесценції використовується в клініці та експерименті.
- Найбільш точними та швидкими методами визначення фагоцитарної активності лейкоцитів є радіометричні. Так, поглинальну здатність оцінюють за рівнем включення ізотопу до фагоцитуючих клітин. Для цього використовують мічені Сr еритроцити, радіоактивну масляну емульсію або мікроби, мічені 14С-гліцином, 3Н-лейцином, 3Н-уридином, або частки 192Ir. Іноді фагоцитоз оцінюють зменшення мітки (32Р) у позаклітинному середовищі.
- Одним із показників функціональної активності макрофагів є рівень активності 5'-нуклеотидази. Активність даного ферменту визначають у суспензії не зруйнованих МФ методом Туманян і Кириличевой. Метод відрізняється простотою та точністю, достовірністю, досить часто використовується.
Необхідно пам'ятати, що ефективність усіх цих показників залежить від низки умов, таких як тривалість інкубації, форми дна судини - круглої та конічної (у конічних пробірках спостерігалися вищі показники фагоцитозу, що, мабуть, обумовлено стимулюючим впливом короткодистанційної взаємодії), pH середовища, змісту кисню та вуглекислоти.
Рух клітин за відсутності хемотаксичного стимулу дає характеристику
випадкової рухової активності (спонтанна міграція) фагоцитів
Вимірювання еластичності клітин можна здійснити в камерах Бойдена.
Адгезивні властивості фагоцитів оцінюють за прилипанням на поверхні скла.
або в колонках з намистом. Між здатністю до розпластування макрофагів, оп-
ределяемой під фазово-контрастним мікроскопом, і фагоцитоз є
певна кореляція
Серед методів реєстрація хемілюмінесценції (ХЛ) є найбільш чутливим та інформативним методом функціональної оцінки фагоцитуючих клітин, але разом з тим і одним з найбільш складних, не так у методичному плані, як у розумінні природи біохімічних та фізичних процесів, що призводять до випромінювання світла. Механізми, що лежать в основі ХЛ фагоцитів, складні та недостатньо вивчені. Світіння може виникати у реакції O2+O1=2O2+hV, важливу роль можуть відігравати радикали ОН-. Аналіз різних інгібіторів світіння призводить до думки, що синглетний кисень, гідроксильний радикал та перекис водню залучені до процесу ХЛ.
ХЛ фагоцитуючих клітин значно посилюється у присутності люмінолу або
люцигеніну.
Запропоновано багато методів реєстрації ХЛ фагоцитарних клітин, ці методи можна поділити на 2 основні класи.
/. Реєстрація власної ХЛ.Посилення власної ХЛ фагоцитуючих клітин спостерігається за стимуляції опсонізованим зимозаном, бактеріями, частинками латексу. Власна ХЛ клітин має низьку інтенсивність і лежить у широкому спектральному діапазоні з максимумом області 400-500 нм. Реєстрація ХЛ вимагає високої чутливості приладу та достатньої кількості виділення клітин (зазвичай не менше 106 клітин). Еритроцити, гемоглобін, сироватка крові пригнічують ХЛ.
2. ХЛ у присутності люмінолу. Світіння має на 2-3 порядки більшу інтенсивність, ніж власна ХЛ. Посилення ХЛ спостерігається при дії зимозану, бактерій, частинок латексу, комплексів антиген – антитіло, іонофору кальцію, хемотаксичних пептидів. ХЛ може спостерігатися в суспензії як виділених клітин, так і клітин у сироватці крові.
Таким чином, хемілюмінесцентний метод дозволяє проводити швидку кількісну оцінку фагоцитарної та бактерицидної активності клітин. Він може використовуватися при дослідженні малих кількостей біологічного матеріалу крові, або може бути як для оцінки стану клітин, так і для оцінки опсонічної активності сироватки та впливу лікарських препаратів.
Радіометричні методи відрізняються швидкістю постановки та об'єктивністю оцінки результатів. Як правило, наприкінці інкубації мікробів з фагоцитами останні руйнують осмотичним лізисом, заморожуванням - розморожуванням або дезоксихолатом натрію, потім додають на 30 хв при 37°С 3Н-тимідин і підраховують радіоактивність осаджених на фільтрі бактерій. За допомогою подвійної мітки визначають одночасно поглинальну та бактерицидну функцію лейкоцитів. Для цього попередньо мітять мікроби одним із ізотопів (14С-фенілаланін, 14С-ацетат натрію), а потім наприкінці інкубації руйнують фагоцити та вносять 3Н-тимідин. Радіоактивність спочатку мічених мікробів, включених у фагоцити, відображатиме їх поглинальну функцію, а радіоактивність, включена в мікроби, після руйнування фагоцитів характеризуватиме їх бактерицидність. Існують авторадіографічні методи оцінки завершеності фагоцитозу включення ізотопу в процесі інкубації на стеклах моношару фагоцитів з мікробами.
III. Деякі моделювані процеси.
ЗНИЖЕННЯ БАКТЕРІАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ ПЕРИТОНЕАЛЬНИХ МАКРОФАГІВ МИШЕЇ В УМОВАХ ПОЄДНАНОГО ЗАСТОСУВАННЯ СТАФІЛОКОККОВОГО
ЕНТЕРОТОКСИНУ ТИПУ А ТА ЕНДОТОКСИНУ
Механізми патогенної дії стафілококових ентеротоксинів (СЕ) вивчені недостатньо. Відомо, що блокада ретикулоендотеліальної системи (РЕМ) торотрастом підвищує чутливість тварин до блювання, індукованого СЕ. Це передбачає, що функціональний статус РЕМ відіграє важливу роль у відповіді організму на ентеротоксин. Дані літератури свідчать і можливості впливу СЕ на функціонування фагоцитуючих клітин. По-перше, введення СЕ мавпам через шлунковий зонд призводить до розвитку гострого гастроентериту з ексудацією нейтрофілів, макрофагів та іншими ознаками запалення. По-друге, найважливішою властивістю СЕ є здатність сенсибілізувати тварин до летальної дії ендотоксинів грамнегативних бактерій (ліпополісахарид - ЛПС), що ставить їх в один ряд з речовинами, що викликають гіперактивацію РЕМ, а також мають сенсибілізуючу дію. Беручи до уваги постійний контакт організму з умовно-патогенними бактеріями, а відповідно і з ендотоксинами кишкової мікрофлори, дослідження макрофагальних функцій, відповідальних за елімінацію мікроорганізмів в умовах впливу СЕ та при поєднанні їх застосування з ЛПС, набуває особливої актуальності. У зв'язку з цим завданням досвіду стало вивчення основних закономірностей зміни фагоцитарної та бактерицидної функцій макрофагів під дією СЕ типу А (СЕА) та ЛПС.
I серію дослідів з вивчення фагоцитарної та бактерицидної активності проводили з макрофагами, отриманими від мишей наступних груп: 1-я – через 2 год після ін'єкції ентеротоксину, 2-я та 3-я – через 24 год після введення СЕА та ЛПС окремо, 4 -я - через 24 години після введення ендотоксину на тлі СЕА. СЕА викликав дворазове зниження загальної кількості клітин через 2 год після ін'єкції; через 24 год загальна кількість клітин, як і раніше, залишалося зниженим. Якщо ЛПС у інтактних мишей сприяв збільшенню виходу клітин у черевну порожнину, то на тлі СЕА їх кількість не тільки не зростала під дією ЛПС, а й достовірно зменшувалась порівняно з контролем.
Вивчення фагоцитарної та бактерицидної активності макрофагів через 2 години після введення мишам СЕА виявило їх помітне зниження порівняно з показниками для контрольних тварин. Через 24 години після ін'єкції СЕА та ЛПС окремо спостерігалося посилення фагоцитозу. Виявлені закономірності зміни фагоцитарної функції макрофагів цілком узгоджуються з даними літератури, присвяченими вивченню кліренсу вугілля у кроликів після введення стафілококових знтеротоксинів. Н. Sugiyama також спостерігав біфазові зміни фагоцитарної функції РЕМ; пригнічення ступеня кліренсу вугілля через 2 години після ін'єкції, що змінюється його збільшенням через добу.
Бактерицидна активність макрофагів, отриманих через 24 години після обробки тварин окремо СЕА та ЛПС, також зростала. У разі спільного введення зазначених токсинів функція поглинання змінювалася незначно, зате ступінь завершеності фагоцитозу різко знижувався. Необхідно відзначити, що дослідження морфологічного складу клітин перитонеального ексудату мишей через 24 години після ін'єкції СЕА та ЛПС не виявило суттєвих відмінностей у відсотковому співвідношенні макрофагів у дослідних групах тварин. Тому можна стверджувати, що виявлені зміни фагоцитарної та бактерицидної функції зумовлені впливом досліджуваних токсинів.
Для уточнення характеру впливу СЕА та ЛПС на функціональну активність макрофагів наступну серію дослідів провели у системі in vitro. З цією метою резидентні перитонеальні макрофаги, отримані від інтактних тварин, інкубували з токсинами протягом 24 год. У цьому випадку функція поглинання змінювалася меншою мірою. Бактерицидна активність, як і в дослідах in vivo, підвищувалася під дією СЕА та ЛПС окремо. При одночасному додаванні токсинів до макрофагів бактерицидна функція збільшувалася, а в умовах, що наближаються до таких in vivo, тобто при додаванні ЛПС через 4 години після СЕА, здатність макрофагів вбивати Staph. aureus також різко знижувалася.
Таким чином, в умовах поєднаного застосування СЕА та ЛПС відбувається різке зниження функції завершеного фагоцитозу макрофагів. Той факт, що в умовах in vitro простежуються ті ж закономірності, що і в системі in vivo, передбачає, що СЕ безпосередньо впливає на макрофагальні функції. Враховуючи, що фагоцитуючі клітини є першою лінією захисту від надзвичайно поширених умовно-патогенних мікробів, зниження бактерицидних властивостей в умовах синергічної дії СЕ з ендотоксинами грамнегативних бактерій в організмі може призвести до розвитку тяжких септичних ускладнень.
СКАСУВАННЯ ПІДСИЛЮЮЧОГО ФАГОЦИТОЗ ДІЇ ОПСОНІНІВ З ДОПОМОГЮ ФРАГМЕНТІВ АНТИТЕЛ ПРОТИ Fc-РЕЦЕПТОРІВ МАКРОФАГІВ
Один з найбільш важливих і давно встановлених імунологічних феноменів – посилення захоплення фагоцитуючими клітинами корпускулярних антигенів після їхньої сенсибілізації IgG-антитілами – залишався тривалий час маловивченим. Після з'ясування принципів структурної організації молекули IgG і виявлення на поверхні фагоцитів і в тому числі макрофагів рецепторів для Fc-ділянки IgG було постульовано, що антитіла, що опсонізують, забезпечують посилення захоплення корпускулярного антигену завдяки взаємодії Fc-ділянки молекули антитіла з Fc-рецептором (FcR). Єдиним експериментальним доказом на користь цього був факт відсутності у Fab-фрагментів антитіл, що опсонізують здатності посилювати захоплення корпускулярного антигену докази залучення FcR в процес захоплення опсонизированного корпускулярного антигену. Подібний експериментальний підхід не можна розглядати як адекватний для прямого доказу залучення FcR процес захоплення опсонизированного корпускулярного антигену. Виходячи із сказаного, було вирішено отримати прямі докази ролі FcR у реалізації механізму посилення захоплення макрофагами корпускулярного антигену, сенсибілізованого IgG-антитілами. Це було досягнуто при оцінці впливу на зазначений процес Fab-фрагментів антитіл проти FcR макрофагів, які, як було встановлено, перешкоджають взаємодії з макрофагами агрегованого IgG. Пре-інкубація перитонеальних макрофагів з Fab-фрагментами анти-FcR-антитіл повністю скасовувала ефект посилення захоплення макрофагами опсонізованого антигену.
В результаті досліду було встановлено, що Fab-фрагмент IgG з анти-FcR-сироватки ефективно блокує FcR мишачих макрофагів, перешкоджаючи зв'язуванню цими клітинами гетерологічного агрегованого IgG. Ці дані добре узгоджуються з фактом блокування FcR перитонеальних макрофагів бівалентними FаЬ-фрагментами з антиFcR. Ці дані в поєднанні з результатами контрольних експериментів, що свідчать про відсутність здатності блокувати FcR Fab-фрагментами IgG з антисироватки проти імунного преципітату, вказують на можливість використання моновалентних Fab-фраг-ментів анті-FcR-антител для вивчення функції FcR макрофагів в реалізації дії. Слід підкреслити, що використання моновалентних фрагментів анти-FcR-антитіл має принципове значення при вивченні функціональної ролі FcR, оскільки на відміну від нерозщеплених антитіл або бівалентних FаЬ-фрагментів моновалентні Fab-фрагменти нездатні, зв'язавшись з FcR, викликати при 37 по цитоплазматичній мембрані та наступний кеппінг.
Отримані дані свідчать, що преінкубація макрофагів з Fab-фрагментами анти-FcR-антитіл повністю скасовує ефект посилення фагоцитозу S.typhimurium (взяту як об'єкт перевірки ефективності фагоцитозу), зумовлений IgG-антитілами кролика проти цього мікроорганізму. Власне, Fab-фрагменти анти-FcR-антитіл не надають будь-якого впливу на фагоцитоз несенсибілізованих антитілами бактерій. Якщо до макрофагів попередньо додавали Fab-фрагменти антитіл кролика проти імунного преципітату, утвореного яєчним альбуміном і IgG-антитілами кролика проти цього антигену, це не впливало на процес фагоцитозу сенсибілізованих антитілами бактеріальних клітин.
Таким чином, Fab-фрагменти анти-FcR-антитіл вибірково пригнічують фагоцитоз тільки сенсибілізованих антитілами бактерій. З урахуванням результатів контрольних експериментів це служить безперечним доказом на користь того, що посилення захоплення корпускулярного антигену після його опсонізації IgG-антитілами обумовлено взаємодією Fc-частина опсонізуючих антитіл з FcR макрофагів.
Привертає увагу той факт, що макрофаги, попередньо оброблені Fab-фрагментами анти-FcR-антитіл, менш ефективно поглинають сенсибілізовані антитілами бактеріальні клітини, ніж несенсибілізовані. Цей результат можна пояснити, виходячи з уявлення, що після сенсибілізації бактерій у частини з них відбувається стеричне екранування ділянки клітинної поверхні, за допомогою якого прикріплюються мікроорганізми до макрофагів. Фагоцитоз таких бактеріальних клітин здійснюється, мабуть, після взаємодії двох молекул антитіл або більше через їх Fс ділянки з декількома FcR на цитоплазматичній мембрані макрофага. Якщо зазначене припущення справедливе, захоплення цієї частини сенсибілізованих бактеріальних клітин буде неможливим після блокування FcR за допомогою Fab-фрагментів анти-FcR-антитіл.
Отримані у цій роботі дані відкривають нові підходи для регуляції процесу імунного фагоцитозу, що може мати важливе значення для детального аналізу ролі цього процесу при різних патологічних станах.
ПОСИЛЕННЯ ЗА ДОПОМОГОЮ ХІТОЗАНУ РЕАКЦІЇ КОНТАКТНОГО ВЗАЄМОДІЇ МАКРОФАГА З ТИМОЦИТАМИ in vitro
Стара та багатогранна проблема імуностимуляції набула нового вираження у зв'язку з пошуком шляхів до створення штучних вакцин. Основні зусилля в даному напрямку пов'язані з отриманням кон'югатів антигенних вакцинуючих детермінант з природними або штучно синтезованими полімерними носіями. Роль носія в такому молекулярному комплексі має полягати у посиленні специфічної відповіді на обрану антигенну детермінанту.
При пошуку ефективного носія, який міг би бути використаний при кон'югації з антигеном, необхідно мати відомості про його ад'ювантний ефект та відсутність побічних патогенетичних властивостей. У зв'язку з цим було звернено увагу на хітозан - гомополісахарид, що виділяється з хітину зовнішнього скелета безхребетних. Молекулярна маса речовини, що вивчається ~ 120000 дальтон.
Мета дослідження – з'ясувати вплив хітозану на процес контактної взаємодії макрофагу з тимоцитами у дослідах in vitro. Звернення до цих клітинних типів не випадкове. Відомо, що взаємодія макрофагу з тимоцитами є додатковим фактором трансформації недиференційованих тимусзалежних клітин на зрілі Т-лімфоцити. У зв'язку з цим цікаво визначити, чи впливає обраний гомополімер на один з ранніх етапів становлення імунної системи - формування функціонально активної популяції зрілих Т-клітин.
Було проведено 3 серії дослідів. У 1-й серії вивчали характер взаємодії сингенових тимоцитів з клітинами перитонеального ексудату, що прилипають, які інкубували безпосередньо перед постановкою реакції з однією з обраних доз хітозану протягом різного часу. Встановлено, що найефективніше реакція гроздеобразования проходить за 30-хвилинної інкубації макрофагів з хітозаном. Кількість тимоцитів, що групуються навколо макрофагу, у 2,5 рази більша порівняно з таким у контролі. У цій же серії дослідів вирішувалося питання інтенсивності взаємодії аналізованих типів клітин залежно від дози, використаного для інкубації хітозану, при оптимальному часі інкубації 30 хв. З'ясовано, що найбільше посилення реакції гроноутворення спостерігається при додаванні до культури 50 мкг полісахариду.
У 2-й серії дослідів аналіз реакції гроноутворення проведено в умовах попередньої 30- та 60-хвилинної інкубації тимоцитів з різними дозами хітозану. Інкубація протягом 30, так і 60 хв призводила до посилення контактної взаємодії тимоцитів з макрофагами. Як і в попередній серії дослідів, оптимальна доза, що посилювала ефект грози, дорівнювала 50 мкг.
У заключній 3-й серії дослідів проведено вивчення інтенсивності гроноутворення при внесенні хітозану безпосередньо в систему макрофаг-лімфоцит, що реагує. Як і в 2 попередніх серіях дослідів, констатовано посилення контактної взаємодії тимоцитів із макрофагами.
Для пояснення виявлених фактів необхідно на увазі, що хітозан є полікатіоном. У той самий час інтегральний заряд як тимоцитів, і макрофагів негативний. Можливо, ефект посилення контактної взаємодії пов'язаний з електростатичними міжклітинними тяжіннями під впливом хітозану, що включають 2 етапи: 1-й етап - адгезія позитивно зарядженого хітозану на макрофазі або тимоциті, 2-й - безпосередня взаємодія негативно зарядженої клітини з клітиною-партнером. з полікатіоном і несе в результаті цього більший позитивний заряд. Подібне уявлення підкріплюється тим, що ефект посилення реакції гроноутворення не пов'язаний зі схемою інкубації і буде однаковим незалежно від того, який тип клітин піддавався інкубації з хітозаном.
Другий момент, який потребує пояснення, - це незначний час інкубації клітин з хітозаном, у якому виявляється ефект посилення контактної взаємодії. Можливо, що відсутність ефекту при більш тривалій інкубації пов'язана з фагоцитоз високомолекулярного полісахариду, внаслідок чого відбувається відновлення вихідного заряду взаємодіючих клітин. Проте подане пояснення має бути підтверджено додатковими експериментальними фактами.
АКТИВАЦІЯ ФАГОЦИТАРНИХ КЛІТИН І КЛІТИННОГО ІМУНІТЕТУ СИНТЕТИЧНИМИ ПОЛІЕЛЕКТРОЛІТАМИ
Ряд перспективних неприродних поліелектролітів, що використовуються для створення синтетичних вакцин, володіє багатьма імуномоделюючими потенціями: вони посилюють міграцію стовбурових клітин, Т-і В-лімфоцитів, є стимуляторами Т-і В-клітин, заміщають хелперну функцію Т-лім. Ці властивості забезпечують сильну стимулюючу дію на реакції гуморального та клітинного імунітету.
Разом з тим, недостатньо ясним залишається питання про їх дію на систему фагоцитарних клітин, формування клітинного, зокрема трансплантаційного, імунітету. Метою цієї роботи було вивчення цих питань.
Методика досліджень була наступною: мишам гібридам (CBAXC57BL/6) внутрішньочеревно вводили різні дози поліелектролітів одноразово, виділяли МФ через 48 год і аналізували їх.
Введення поліаніону NA-5 викликає у макрофагах мишей активацію гліколізу. Наприклад, у 3 експериментах посилення гліколізу порівняно з контрольними клітинами було у 1,45, 2,35, 4,3 рази. Це дуже сильна активація гліколізу в клітинах, що свідчить про перехід їх на вищий фізіологічний рівень метаболізму. Значно зростала в клітинах та інтенсивність гексозомонофосфатного шунту: у 2 з 3 дослідів введення поліаніону супроводжувалося появою макрофагів із середньою активністю окислення глюкози, що відповідає 8,67+1,47 та 7,24+1,95 МФЕ на 10б клітин (в 17+0,95 та 4,1 + 1,29 МФЕ на 106 клітин). Ще сильнішою виявилася інтенсифікація циклу сечовини, відмінності якого, порівняно з контрольними клітинами, були вже порядковими. Наприклад, у дослідах 1-3 вони становили відповідно 8,43, 11,54 та 2,06 рази.
Істотне посилення гліколізу обумовлювалося також введенням тварин карбоцепного поліаміну Н-З: у 2 з 3 дослідів активація була значною, для ЛДГ вона становила в дослідних макрофагах відповідно 89,27+7,41 і 39,54±4,56 МФЕ на 106 клітин, у контрольних - 26,36+8,36 та 20,59+3,86 МФЕ на 106 клітин. Так само вираженим було посилення активності окислення глюкози, яке перевищувало його в дослідних макрофагах у порівнянні з контрольними у 3 експериментах відповідно у 2,11, 1,28 та 1,41 разу.
Вкрай значною була інтенсифікація циклу сечовини, оскільки активація ключового ферменту АРГ зростала в різних дослідах у 3,65-54,6 раза.
У той же час активність полікатіону D11-100е була значно менш виражена, він істотно не впливав на стан гліколізу і гексозомонофосфатного шунту макрофагів. Проте активність циклу сечовини в клітинах достовірно збільшувалася, хоча й менш істотно, ніж під впливом Н-3 і NA-5.
У макрофагах мишей, стимульованих поліаніоном NA-5, майже дворазово підвищувалася активність лізосомальних гідролаз, становлячи у досвіді 27,42+4,09 нМ Р/год на 10б клітин та у контролі 15,04+3,66 нМ P/год на 10б клітин. Активність КФ після введення мишам Н-3 була ще більшою – 35,51+4,82 нМ P/год на 10б клітин. Подібне посилення свідчить про суттєве зростання в макрофагах здатності, що перетравлює.
У макрофагів мишей поліаніон NA-5 викликав не лише інтенсифікацію деяких шляхів метаболізму, а й підвищення експресії рецепторів до IgG, яке було нерізко вираженим, але статистично достовірним.
Дозозалежною виявилася відповідь клітини, що виявляється за генерацією кисневих радикалів у мишей, яким вводили різні дози поліаміну Н-3. Так, якщо доза 0,5 мг/миша пригнічувала хемілюмінесценцію макрофагів при фагоцитозі, не змінюючи її при адгезії клітин на скло, то дози 1, 5 та 10 мг/миша вже обумовлювали суттєве зростання хемілю-мінесценції при фагоцитозі частинок. При адгезії ці дози також активізуються, за винятком дози 5 мг/миша. Оптимальне посилення генерації активних кисневих радикалів викликало введення тваринам 1 мг/миша препарату Н-3 - у цьому випадку підвищувалася хемілюмінесценція максимально при фагоцитозі, і при адгезії. Подальше збільшення дози не супроводжувалося підвищенням на клітини. Подібне спостереження повністю підтверджується даними літератури щодо впливу цього препарату на різні імунологічні параметри.
Таким чином, синтетичні поліелектроліти-поліаніон NA-5 та карбоцепний поліамін Н-3 викликають активацію макрофагів, посилюючи гліколіз, гексозомонофосфатний шунт, цикл сечовини, активність лізосомальних гідролаз. Препарати також підвищують експресію на плазматичній мембрані макрофагів Fcv-peцепторів. Є, проте, особливості, які у тому, що й Н-3 викликає посилення генерації макрофагами активних кисневих радикалів, полианион NA-5 виявляється у цьому відношенні неактивним. Полікатіон D11-100е менш виражено впливає на макрофаги, проте істотно підвищує на них експресію Рс7-рецепторів, інтенсифікує цикл сечовини.
Формування трансплантаційного імунітету вивчали у тварин, які отримували одноразово внутрішньочеревно по 1 мг/мишу препаратів на день трансплантації шкіри.
Результати свідчили, що всі три препарати викликали посилення трансплантаційного імунітету, що виражається в достовірному прискоренні відторгнення трансплантату у мишей, яким їх вводили. Причому, як і інших моделях, зокрема під час аналізу стану макрофагів за умов впливу препаратів, активність полііону D11-100е поступалася активності NA-5 і Н-3. Можна зробити висновок, що полііон NA-5 і карбоцепний поліамін Н3 мають здатність посилювати клітинний Т-опосередкований імунітет, менш активним був D11-100е.
АКТИВАЦІЯ МАКРОФАГІВ ПІД ВПЛИВОМ СИНТЕТИЧНОГО АНТИОКСИДАНТУ
Зараз загальноприйнятою вважається закономірність: активація макрофагів (МФ) пов'язана з метаболічним (окислювальним) вибухом, з активацією глюкозомонофосфатного шунту (ГМФШ), з продукцією та секрецією високоактивних нестабільних продуктів відновлення кисню - супероксиданіонів О2~, перекису водой синглетного кисню (О2).
Надлишок токсичних супероксидних радикалів, що утворюється при цьому, а також ліпоперекиси, що накопичуються у фагосомах МФ в процесі фагоцитозу, можуть зумовлювати окисне пошкодження клітинних мембран і пов'язане з цим придушення функцій МФ. У МФ описана власна система антиоксидантного захисту, що включає супероксиддисмутазу, що видаляє надлишок супероксидних радикалів, а також глутатіонпероксидазу і НАДФ-залежну глутатіонредуктазу, що нейтралізують ліпоперекиси.
Однак за недостатності ендогенних антиоксидантів можуть виникати різні порушення функцій МФ. Було показано, що алкілзаміщені похідні 3-оксипіридину (8 ОП), які мають помірну антиокислювальну дію, є ефективними інгібіторами вільнорадикальних реакцій і можуть бути використані для захисту від деструктивного впливу вільних радикалів.
Метою роботи було вивчення впливу синтетичних антиоксидантів на функції МФ. З ряду синтетичних похідних ВП були обрані 2-третбутил-З-оксипіридин (ТБОЗ), у якого була описана здатність стабілізувати мембрани еритроцитів. Дослідження проводилися у порівнянні зі стандартним активатором МФ – бактеріальним ліпополісахаридом (ЛПС з Е. coli О55).
Дані, отримані щодо безпосереднього впливу ТБОЗ у порівнянні з ЛПС на перитонеальні МФ такі: для активації ГФДГ достатньо півгодинної інкубації клітин з ТПВП. Судячи з показників приросту активності ферменту, ефект ТБОЗ аналогічний дії стандартного активатора - бактеріального ЛПС. Частка розпластаних МФ зростає порівняно з контролем вже через 2 години інкубації з випробуваними препаратами. На ранніх термінах (2 год) ефект ТБОЗ більш виражений порівняно з ефектом стандартного активатора - ЛПС. На пізніших термінах культивування (24 год), активуючий ефект ЛПС продовжує наростати, водночас частка розпластаних МФ під впливом ТБОЗ має тенденцію до зниження проти ранніми термінами, але залишається достовірно підвищеної проти поступово зростаючим контрольним рівнем.
Після внутрішньочеревного введення ТБОЗ вже через 1 год він викликає чітке підвищення кількості клітин у черевній порожнині за рахунок МФ з переважним накопиченням великих МФ, причому цей ефект аналогічний дії ЛПС.
МФ, витягнуті з черевної порожнини мишей через 1 годину після внутрішньочеревного введення ТБОЗ, відрізнялися посиленим розпластуванням порівняно з МФ контрольних тварин. Фагоцитарна активність цих МФ була підвищеною, судячи з інтенсивності захоплення ними клітин Candida albicans. У умовах експерименту ТБОП проти стандартним активатором - бактеріальним ЛПС - більшою мірою активує розпластування, а фагоцитарную активність підвищує меншою мірою. У пізніші терміни після введення досліджуваного препарату (1.5-24 год) подальшого наростання кількості МФ у черевній порожнині та їх функціональної активності не спостерігали. На відміну від цього після введення ЛПС кількість МФ у черевній порожнині та їх функціональна активність досягали максимального рівня лише через 24 год.
У зв'язку з виявленими тимчасовими відмінностями стимулюючих ефектів щодо впливу препаратів на інтенсивність очищення черевної порожнини мишей від введених бактерій S. typhimurium (кліренс) ЛПС вводили за 24 год, а ТБОЗ - за 1 год до зараження. Для оцінки кліренсу обчислювали середні різниці логарифмів концентрації бактерій через 1 годину після зараження у мишей контрольних та досвідчених груп. Було виявлено значне відставання інтенсивності кліренсу у мишей, які отримали за 4 діб до зараження по 1 мл середовища з тіогліколятом порівняно з контролем.
На малюнку видно, що ні ТБОЗ, ні стандартний активатор МФ бактеріальний ЛПС впливають інтенсивність очищення черевної порожнини від введених бактерій. Однак на тлі дефекту бактерицидності МФ, індукованого попереднім введенням середовища з тіогліколятом, обидва препарати однаково достовірно підвищують вихідно знижену інтенсивність очищення черевної порожнини мишей. Під впливом ТБОЗ, як і під впливом бактеріального ЛПС, спостерігали нормалізацію рівня очищення черевної порожнини, тобто корекцію модельованого в експерименті дефекту бактерицидності МФ.
Таким чином, у вивченого синтетичного антиоксиданту ТБОЗ виявлено здатність активувати мишачі перитонеальні МФ при безпосередньому впливі in vitro. Після внутрішньочеревного введення того ж препарату спостерігали підвищення кількості МФ у черевній порожнині та їх функціональної активності. У мишей із попередньо індукованим дефектом функції кліренсу черевної порожнини препарат сприяв відновленню нормального рівня антибактеріального захисту. За всіма вивченими тестами активуючої дії на МФ синтетичний антиоксидант не поступався стандартному активатору МФ - бактеріальному ЛПС. При введенні мишів ТБОЗ спостерігали більш ранні прояви активації МФ порівняно з ефектами ЛПС.
ФАГОЦИТАРНА АКТИВНІСТЬ МАКРОФАГІВ ПЕРИТОНЕАЛЬНОГО ЕКССУДАТУ МИШЕЙ ПРИ ДІЇ ПРЕПАРАТІВ ПЛАТИНИ
Макрофаги здатні викликати лізис різних типів пухлинних клітин, не пошкоджуючи нормальні клітини того ж таки гістогенезу. Нормальні "неармовані", неактивовані макрофаги здійснюють взаємодію з пухлинними клітинами на стадії їх виникнення та в період початкової стадії їх розвитку. Речовини-цитостатики, що застосовуються в хіміотерапії новоутворень, впливають на імунну систему макроорганізму, зокрема, вражаючи систему мононуклеарів. Вплив різних класів цитостатиків на функціонування макрофагальної ланки імунітету досить глибоко вивчений. Однак даних про характер впливу нового класу протипухлинних сполук – координаційних сполук платини на макрофаги у доступній літературі не зустрічається. Було проведено дослідження – визначення дії препаратів платини на фагоцитарну активність макрофагів перитонеального ексудату. Як препарати були взяті Оксоплатину (цисдихлородіамінтрансдігідроксоплатину IV виробництва фірми “Lachema”) та циклоплатам (амінциклопептиламін-5-малатоплатину (II) вітчизняного виробництва).
У ході проведених досліджень було встановлено, що привнесенні препаратів платини безпосередньо в пробірки для рахунку при реєстрації хемілюмінесценції в дослідах in vitro відбувається незначне збільшення вивільнення гідроксильного радикалу (ОН~), супероксиданіону (О2-), синглетного кисню ("02), перекису водню ( H202), що опосередковано дозволяє судити про стимуляцію фагоцитарної активності перитонеальних макрофагів препаратами платини in vitro.Так, для циклоплатама максимальне збільшення утворення активних метаболітів кисню спостерігалося в дозі, що дорівнює 0.5 МПД (LD=23 мг/кг), та індекс хемілюмінес 2 порівняно з 2,28 у контролі, тоді як додавання оксоплатини в дозі, що дорівнює 1/4 МПД, до суспензії перитонеальних макрофагів викликало збільшення індексу хемілюменісценції з 1,69 у контрольних пробах до 2,62 у досвіді.
Неоднозначні та досить суперечливі результати були отримані при подальшому дослідженні впливу оксоплатини та циклоплатами на фагоцитарну функцію перитонеальних макрофагів in vivo (при введенні препаратів внутрішньочеревно мишам). Введення оксоплатини та циклоплатаму неімунним мишам викликало пригнічення фагоцитозу (на 1-й день після введення циклоплатаму у всіх дозах, на 1-й та 2-й дні після введення оксоплатини у всіх дозах, із встановленням стимулюючого впливу в наступні дні для обох препаратів).
Однак введення оксоплатини і циклоплатама в тих же дозах в аналогічні терміни разом із антигенною стимуляцією дало протилежний ефект. На 1-й день після введення обидва препарати викликали дозозалежне збільшення індексу хемілюмінесценції на 2 і більше порядку (індекс хемілюмінесценції ІХЛ для оксоплатини в дозі 1,0 МПД становив 106,9, для циклоплата в дозі 1,0 МПД - 4 як у контролі – 1,3-2,5). У наступні дні після введення препаратів імунним мишам стимулюючий вплив на фагоцитарну активність перитонеальних макрофагів простежувалося чітко для всіх доз, але мало менш виражений характер.
Передбачається, що при поясненні такого явища не можна залишити поза увагою факт гетерогенності перитонеальних макрофагів і неминучої реакції на внутрішньочеревне введення алоантигена, що виражається в перерозподілі субпопуляцій перитонеальних макрофагів на користь про запальні на відміну від резидентних. Не виключена поява незрілих резидентних макрофагів, що також характеризуються більшою пероксидазною активністю.
Однак можливо, що при подібній постановці реакції реєструвався факт захоплення та поглинання перитонеальними макрофагами частинок, якими могли бути (і явно були) не тільки гранули зимозану, а й гетерологічні еритроцити барана. На користь цього свідчать дані роботи, виконаної X. М. Ісіною в лабораторії І. Я. Вчителя, про те, що саме в 1-у добу після імунізації відбуваються максимальне захоплення, поглинання та руйнування макрофагами гетерологічних еритроцитів з наступною (до 48-го години) стабілізацією процесу. Тому робиться висновок, що першу добу введення не можуть розглядатися як основоположні при затвердженні стимулюючого впливу оксоплатини та циклоплати на фагоцитарну активність перитонеальних макрофагів, тоді як результати наступних днів є достовірним підтвердженням такого явища.
ВИВЧЕННЯ ФАГОЦИТАРНОЇ АКТИВНОСТІ ПЕРИТОНЕАЛЬНИХ МАКРОФАГІВ ЩОДО YERSINIA PESTIS З ДЕФЕКТНИМИ І ПОВНОЦІННИМИ FRA-ГЕНАМИ
Відомо, що можливість розвитку чумної інфекції багато в чому визначається результатом взаємодії клітин збудника Y. pestis з фагоцитами, який залежить від ступеня антибактеріальної активності макрофагів (МФ) і наявності антифагоцитарних факторів у мікробів. До антифагоцитарних субстанцій Y. pestis відносять термоіндукований капсульний антиген "фракція I", антигени вірулентності V, W, I та ін. Не виключено існування неідентифікованих компонентів з тією ж функцією. Дія фракції I пов'язують з інгібіцією бактерицидної активності МФ, її участь у процесі захоплення бактерій МФ заперечується. Специфічна імунізація тварин призводить до зміни МФ, що сприяє прискоренню поглинання вірулентних та вакцинних штамів Y. pestis та подальшого їх лізису. В останні роки встановлено, що детермінанти фракції I і VW-антигенів локалізовані на плазмідах, які, цілком імовірно, несуть і іншу генетичну інформацію, поки що не ідентифіковану, але можливо пов'язану з антифагоцитарною активністю Y. pestis. Наявні в літературі дані про фагоцитоз при чумі отримані в дослідах, у яких не ідентифікувалося, чи пов'язане порушення синтезу досліджуваних антигенів з дефектом окремих конкретних генів або втратою відповідної плазміди. Остання подія може викликати одночасно дефектність інших, ще не досліджених антигенів. Це ще потребує уточнення.
Мета роботи - визначення вкладу фракції I у процес взаємодії збудника чуми з індукованими МФ імунізованих та інтактних експериментальних тварин.
У дослідах використовували природний вірулентний штам Y. pestis 4 (Fra+) та ізогенний штам 4 (Fra-), у якого синтез фракції I був "вимкнений" вбудовуванням елемента Tn10 у відповідний ген плазміди. Випробовували по 3 клони кожного штаму. Бактерії перед досвідом вирощували протягом 48 годин при 28 і 37 °С на агарі LB (Difco) рН 7,2. Фагоцитоз вивчали in vitro у культурі індукованих перитонеальних МФ морських свинок та білих мишей, інтактних та імунізованих підшкірно одноразово в дозі 106 мікробних клітин (МК) чумною вакциною. У дослідах із фагоцитами навантаження становило 50 мікробних клітин (мк) на МФ. Проби інкубували при 37 °С протягом 6 годин. Інтенсивність фагоцитозу оцінювали за допомогою показника активності фагоцитів (АФ) та індексу завершеності фагоцитозу (ІЗФ).
Всі вивчені бактерії, вирощені при 28 ° С (28 °-культури), коли синтез фракції I знаходиться на дуже низькому рівні, поглиналися однаково незалежно від здатності їх fra-генів нормально функціонувати і від того, виділені МФ, що випробовуються, від імунізованих або інтактних тварин . У дослідах з бактеріями, вирощеними при 37 °С (37 °-культури), ефективність захоплення (АФ) у всіх пробах була значно нижчою, ніж при 28 °С. Оскільки зниження спостерігали у штамів як здатних, так і нездатних продукувати фракцію I , зроблено припущення, що в 37°-культурі має місце індукція синтезу або прояв функцій не фракції I, а додаткових компонентів клітинної стінки бактерій, що заважають встановленню контакту бактерій і МФ. Потрібна подальша робота з ідентифікації цих компонентів.
МФ білих інтактних мишей однаково захоплювали бактерії Fra+- і Fra-, МФ імунізованих мишей дещо активніше поглинали Fra+-бактерії. МФ морських свинок незалежно від того, отримані вони від інтактних або імунізованих тварин, активніше захоплювали Fra+-бактерії. Схоже, що в організмі морських свинок щодо випробуваних МФ фракція I виявляє себе як неспецифічний стимулятор фагоцитозу, тоді як у МФ білих мишей має відбутися специфічна перебудова, що супроводжує імунізацію, перш ніж фракція I виявиться здатною слабко стимулювати захоплення бактерій збудника. Більш високі значення АФ у вакцинованих морських свинок щодо як Fra+-, так і Fra-культур збудника чуми, вирощених при 37 °С, дозволяють думати також про появу у бактерій при цій температурі культивування додаткових факторів, які мають вибіркову активність саме щодо МФ морських свинок. Ще більш виражений стимулюючий ефект цих додаткових факторів проявляється при контакті МФ імунізованих морських свинок з 37-культурами, що містять фракцію I, що дозволяє припустити також і специфічний елемент дії цього антигену, спрямований на посилення захоплення бактерій зазначеними фагоцитами.
Іншими словами, дані експериментів свідчать, що крім фракції I, збудник чуми, вирощений при 37 °С, містить компоненти, що знижують фагоцитарну активність МФ інтактних та імунізованих тварин, та компоненти, що специфічно сприяють захопленню бактерій МФ морських свинок. Дія останніх частково чи повністю у присутності фракції І нейтралізує ефект неідентифікованих негативних факторів. Фракція I сприяє захопленню бактерій чуми МФ і найбільше для морських свинок.
У загальному вигляді висновки з даного експерименту можна зробити наступні: 1. Імунізація чумною вакциною морських свинок індукує специфічну щодо фракції I перебудову в макрофагах, що зумовлює посилення захоплення та перетравлення Fra+-Y. pestis, що виросли при 37 °С. Подібного немає у білих мишей.
2. Дефект Y. pestis по fra-генам і відсутність фракції I обумовлюють більш виражене зниження ефективності захоплення бактерій, вирощених при 37 ° С макрофагами морських сві-
нок, але не білих мишей і великий ступінь перетравлення макрофагами морських свинок за всіх умов досвіду, а макрофагами білих мишей - тільки щодо 37 °-культур.
3. Як у захопленні, і завершенні фагоцитозу роль фракції більш істотна в макрофагах морських свинок.
ВПЛИВ МОДИФІКАТОРІВ БІОЛОГІЧНОГО ВІДПОВІДЮ ПРИРОДНОГО ПОХОДЖЕННЯ НА ФУНКЦІОНАЛЬНУ АКТИВНІСТЬ МАКРОФАГІВ (ОНКОЛОГІЧНИЙ АСПЕКТ)
Незважаючи на значні успіхи хіміотерапії деяких видів злоякісних новоутворень, результати застосування протипухлинних хіміопрепаратів при найпоширеніших локалізаціях раку залишаються задовільними. Стає все більш очевидним, що однією з основних перешкод для успішної хіміотерапії злоякісних пухлин є гетерогенність популяції неопластичних клітин, яка виражається, зокрема, у наявності в ній клонів клітин, резистентних до хіміотерапевтичних агентів. Більше того, така резистентність може належати до цілих класів препаратів, що може обмежувати ефективність і комплексної поліхіміотерапії. Ще більше ускладнює становище генетична нестабільність пухлинних клітин, які, маючи високий рівень спонтанних мутацій, надзвичайно легко піддаються мутагенному впливу хіміопрепаратів та продуктів їхнього метаболізму. Це значною мірою посилює гетерогенність пухлинної популяції, сприяє генерації ще більшої кількості резистентних до хіміотерапії клонів, посилює їх здатність до метастизування, рецидиву на тлі хіміотерапії, що продовжується.
У кінцевому підсумку навіть дуже радикальна (на 99,5 %) редукція пухлинної маси у процесі хіміотерапії майже неминуче призводить до відновлення процесу з допомогою резистентних клонів - попередніх чи виникли у процесі хіміотерапії. Більше того, такі клони виявляються в стадії пухлинної прогресії, що далеко зайшла, і, отже, більш злоякісними.
У цих умовах цілком закономірними виявляються пошуки шляхів елімінації пухлинних клітин із так званою множинною лікарською стійкістю за допомогою інших механізмів, зокрема, політичного потенціалу імунокомпетентних клітин. Особливий інтерес у цьому плані представляють макрофаги. На відміну від інших типів імуноцитів їх активність меншою мірою пригнічується в процесі інтенсивної циторедуктивної терапії, вони здатні до ефективних протипухлинних реакцій у співвідношенні ефектор/мішень, що наближається до 1:1 і, інфільтруючи пухлинну строму, мають достатній контакт. Показано можливість активації цитолітичної дії макрофагів за допомогою різних модифікаторів біологічної відповіді (МПВ) після впливу протипухлинних хіміопрепаратів, тоді як активність інших ефекторних систем може бути суттєво пригнічена. Тому нині триває активна розробка методів ад'ювантної імунотерапії із включенням активаторів макрофагів. При цьому попередня оцінка ефекту останніх проводиться in vitro і переважно за здатністю індукувати цитолітичну та цитостатичну активність. За збереженням такої здатності в процесі застосування хіміотерапевтичних протипухлинних препаратів оцінюється і сумісність МПВ з ними. Однак індукція цитотоксичності є лише однією стороною активації макрофагів, під впливом МПВ відбуваються інші значні зміни функціональної активності цих клітин, зокрема посилюється продукція та секреція цілого ряду ростових факторів. В рамках такого підходу було вивчено вплив БЦЖ та циклофосфаміду на перитонеальні макрофаги мишей. Названі препарати обрані як модельні з огляду на їх достатню вивченість як індукторів протипухлинної активності макрофагів in vitro та in vivo, а також досить широкого застосування в клінічній практиці.
Відомо, що цитотоксична активність макрофагів in vitro досягає свого максимуму до 48-72 год культивування, а потім швидко знижується. Було проведено оцінку зростання стимулюючої активності резидентних та БЦЖ-активованих макрофагів у процесі культивування in vitro.
Встановлено, що здатність підтримувати зростання пухлинних клітин прогресивно знижується у резидентних макрофагів та наростає у БЦЖ-активованих. Якщо в перші 3 дні приріст числа клітин на БЦЖ-активованих макрофагах достовірно нижче, ніж на резидентних (що може бути пояснено цитотоксичною активністю), потім спостерігається протилежна ситуація.
Таким чином, якщо індукована БЦЖ-активація протипухлинної активності макрофагів носить тимчасовий характер, активація продукції ростових факторів більш стійка в часі. Більш того, при тестуванні цитотоксичної та ростстимулюючої активності макрофагів, що виділяються з перитонеальної порожнини мишей у різні терміни після введення БЦЖ, було виявлено, що цитотоксична активність (цитолітична та цитостатична) максимальна на 10-й день. На 15-й та 20-й дні проявляється лише цитолітична, а цитостатична активність зникає. Ростстимулююча активність максимальна на 15-й та 20-й дні. Отже, in vitro активація макрофагів БЦЖ призводить до транзиторної експресії протипухлинної активності та тривалої стійкої ростстимулюючої активності.
З урахуванням цих даних стає зрозумілим характер взаємодії БЦЖ-активованих макрофагів та пухлинних клітин у процесі тривалого ко-культивування in vitro: у перші дні за рахунок цитотоксичності значно знижується кількість життєздатних клітин, одночасно цитостатичні фактори гальмують їх проліферацію, але потім завдяки ростовим факторам, що виділяються, інтенсивність проліферації пухлинних клітин, що вижили, значно перевищує таку у резидентних макрофагів, в результаті чого їх загальна кількість досягає і навіть перевищує вихідний рівень.
У ряді випадків при культивуванні малих доз пухлинних клітин - до 10 на лунку (тобто у співвідношенні ефектор/мішень 5000:1) - цитотоксичної активності може бути достатньо для елімінації всієї пухлинної популяції, проте в тих випадках, коли ростова фракція перевищить поріг цитотоксичної активності, спостерігається інтенсивне зростання пухлинних клітин, що залишилися. Саме це пояснює відсутність достовірності результатів культивування малих доз клітин, оскільки відхилення від середньої величини відрізнялися більшою амплітудою.
Таким чином, здатність макрофагів, активованих БЦЖ, контролювати зростання пухлинних клітин in vitro обмежена і проявляється тільки у співвідношеннях ефектор/мішень, дуже далеких від реально можливого in vivo - 500:1 - 5000:1. При цьому протипухлинна активність транзиторна, а пухлинна носить більш тривалий і стійкий характер. Тому було зроблено спробу потенціювати протипухлинну активність БЦЖ-активованих макрофагів шляхом впливу на них циклофосфамідом. За даними літератури, цей протипухлинний препарат є цілком "сумісним" з БЦЖ-агентом (тобто стимулює БЦЖ-індуковану цитотоксичність) і, отже, може бути компонентом комбінованої хіміоімунотерапії на основі застосування БЦЖ.
Циклофосфамід вводили мишам внутрішньочеревно в дозі 200 мг/кг, за 9 днів до того, що отримали також внутрішньочеревно 1 мг БЦЖ. Наступного дня перитонеальні клітини виділяли і оцінювали їх цитотоксичну активність, здатність підтримувати зростання пухлинних клітин у субоптимальних концентраціях і впливати на зростання пухлинної популяції, що автономно зростає, в умовах кокультивування. Виявилося, що циклофосфамід самостійно індукував суттєву цитолітичну та цитостатічну активності, крім того, достовірно посилював БЦЖ-індуковану цитотоксичність. на лунку) був 2,9"104±3,25-103 і значно перевищував такий при культивуванні пухлинних клітин на БЦЖ-активованих макрофагах - 3,7-103±1,4-102, практично не відрізняючись від їх зростання в присутності нестимульованих макрофагів – 3,2-104±4,82-103.
Таким чином, незважаючи на вельми високий рівень цитотоксичності макрофагів, індукований їх обробкою слідом за БЦЖ ще й циклофосфамідом, такі макрофаги втрачали здатність навіть до обмеженого контролю куль-тивується з ними популяції пухлинних клітин.
З урахуванням дуже значної в цій серії експериментів втрати клітин під впливом факторів цитотоксичності (в окремих дослідах цитолітична активність досягала 70%) і приросту клітин, порівнянного з таким після кокультивування на резидентних макрофагах, можна вважати, що спільне застосування БЦЖ та циклофосфаміду надає адитивне Вплив на продукцію ростових факторів макрофагами.
Таким чином, наявні в літературі дані про сумісність БЦЖ і циклофосфаміду, цілком справедливі щодо протипухлинної активності активованих макрофагів, не відображають можливого кінцевого результату такого поєднання, явно небажаного з клінічної точки зору. Слід зазначити, що характеру відповіді макрофагів на активацію МБО in vivo має схожість з таким in vitro. Як показано ще в перших роботах із застосування БЦЖ, імунотерапія цим препаратом ефективна тільки протягом короткого терміну, а потім відбувається стимуляція пухлинного процесу, причому протипухлинну активність макрофагів, що досить швидко згасає як in vitro, так і in vivo, як правило, не вдається відновити повторними введеннями препарату, що її викликав, і у разі успіху така реактивація є короткочасною.
Дані літератури досить однозначно вказують на відсутність кореляції між цитотоксичною активністю БЦЖ-активованих макрофагів in vitro та їх впливом на пухлинні клітини in.vivo. Якщо виходити з поданих нами даних, це стає цілком зрозумілим: знищення in vitro навіть більшості пухлинних клітин при подальшому стимулюванні зростання решти призводить до явного нівелювання ефекту цитолітичної дії, особливо якщо врахувати його відносну короткочасність у порівнянні з ростстимулюючою дією. Крім того, цито-статистична активність, що виявляється in vitro, залежить від таких факторів, як аргіназа, виснаження культурального середовища через підвищений метаболізм активованих макрофагів, продукція токсичних радикалів, атомарного кисню та ін. В умовах in vivo ці ефекти можуть не проявлятися у зв'язку з припливом аргініну , інших поживних речовин до клітин, наявністю антагоністів радикалів і т.д.
Як відомо, при пухлинному процесі макрофаги сприяють розвитку пухлини на “органному” рівні шляхом покращення мікрооточення (мається на увазі стимуляція ангіогенезу, формування строми пухлини, елімінація продуктів розпаду пухлинних клітин). Продуковані макрофагами імуносупресивні фактори, зокрема простагландин Е2,здатні інактивувати інші імунологічні механізми резистентності до пухлинного зростання. Такі фактори, як інтерлейкін-1 (ІЛ-1), фактор некрозу пухлини (ФНП), що виділяються активованими макрофагами, здатні пригнічувати проліферацію більшої частини відомих ліній пухлинних клітин, проте вони є стимуляторами росту деяких з них.
Враховуючи високий рівень гетерогенності пухлинної популяції та посилення зростання такої під впливом продуктів активованих макрофагів, не можна виключити появи стійких і навіть залежних від ФНП та ІЛ-2 клонів. І якщо відносно нетривалих до часу термінах взаємодії макрофагів і пухлинних клітин в умовах експериментальних моделей такі ефекти не виявляться, то в реальних умовах ймовірністю такого відбору нехтувати не можна. Це особливо актуально, якщо враховувати, що макрофаги практично неминуче залучаються в реалізацію будь-якого імунотерапевтичного впливу, тому продемонстровані негативні наслідки їх активації можуть позначитися і на ефективності всієї програми імунотерапії, спрямованої спочатку на інші ефектори імунної системи.
Таким чином, продукція макрофагами факторів, що стимулюють зростання пухлинних клітин, є суттєвим компонентом відповіді цих клітин на МПВ. Відповідно при оцінці та відборі потенційних МПВ необхідно оцінювати не тільки їх здатність до індукції протипухлинних реакцій, а й можливість експресії побічної ростстимулюючої активності. Тільки поглиблене вивчення цього питання., спрямованого на виявлення факторів, що стимулюють зростання пухлинних клітин, шляхів їх біосинтезу в макрофагах та їх регуляцію, може лягти в основу розробки методів селективного придушення небажаних в онкологічній ситуації зростання стимулюючих властивостей активованих МБО макрофагів. активності.
ПЕРИТОНЕАЛЬНІ МАКРОФАГИ ЯК МОДЕЛЬ ДЛЯ ВИВЧЕННЯ АТЕРОГЕННОГО ПОТЕНЦІАЛУ СИВОРОТКИ КРОВІ
Накопичення ліпідів у гладком'язових клітинах (ГМК) та макрофагах інтими аорти є характерною рисою атеросклерозу людини та експериментальних тварин. Було показано, що сироватки крові хворих на ішемічну хворобу серця (ІХС) з ангіографічно підтвердженим коронарним атеросклерозом на відміну від сироваток крові здорових осіб мають здатність викликати накопичення ліпідів в культивованих клітинах інтими аорти людини. Ця властивість була названа атерогенністю, оскільки накопичення ліпідів супроводжувалося іншими атеросклеротичними проявами на клітинному рівні – посиленням проліферативної активності та синтезу позаклітинного матриксу. Однак зв'язок між атерогенністю та атеросклерозом остаточно не з'ясований.
Дослідження з цієї проблеми ґрунтуються на первинному культивуванні субендотеліальних клітин інтими аорти людини. Складність роботи обумовлена необхідністю постійного забезпечення стерильним аутопсійним матеріалом, а також високою вартістю виділення та культивування клітин.
Раніше було показано, що здатність акумулювати внутрішньоклітинно холестерин при культивуванні з атерогенною сироваткою мають ГМК аорти людини та мононуклеарні клітини периферичної крові. Ці дані дозволяють вважати, що для визначення атерогенності сироватки крові можуть бути використані не тільки субендотеліальні клітини інтими аорти.
Метою роботи було визначення можливості використання легкодоступних перитонеальних макрофагів визначення атерогенності сироватки крові.
Кров для досліджень би взята у хворих на ІХС, підтверджену при коронарній ангіографії, та здорових донорів. ГМК були виділені з аорти чоловіків, взятої в асептичних умовах через 24 години після раптової смерті, що ступила від інфаркту міокарда. Людські перитонеальні макрофаги були виділені з асцитичної рідини хворих на недостатність кровообігу. Мишачі перитонеальні МФ отримані від нестимульованих мишей.
Вплив сироватки крові здорових донорів та хворих на ІХС на рівень холестерину в клітинах
Інтими аорти
медії аорти
Мишачі макрофаги
Людські макрофаги
У таблиці наведено вміст загального холестерину в ГМК інтими та медії аорти людини, у перитонеальних мишачих та людських макрофагах, інкубованих 24 год у присутності 20 % сироваток крові здорових донорів та хворих на ІХС. Видно, що інкубація клітин у 20% сироватці крові здорових донорів не призводить до статистично значущого підвищення рівня холестерину в клітинах, а інкубація у 20% сироватці крові хворих на ІХС викликає достовірне підвищення вмісту внутрішньоклітинного холестерину як у ГМК, так і в перитонеальних макрофактах. Таким чином, так само, як ГМК інтими та медії аорти, перитонеальні макрофаги мишей та людини можуть бути використані для оцінки атерогенного потенціалу сироватки крові. Крім того, накопичення холестерину в макрофагах відбувається в 1,5-2,5 рази швидше, ніж у ГМК. Обидва ці факти, а також легший спосіб одержання культури макрофагів дозволяють вважати, що ці клітини можуть бути використані для оцінки атерогенного потенціалу сироватки значно частіше, ніж ГМК.
При культивуванні мишачих, людських макрофагів та ГМК з 10 атерогенними та 10 неатерогенними сироватками крові встановлено прямий кореляційний зв'язок між акумуляцією холестерину в макрофагах та ГМК інтими аорти. Крім того, акумуляція холестерину в людських та мишачих макрофагах знаходиться у прямій залежності від концентрації сироватки (рис 1) та часу культивування (рис 1А). При культивуванні макрофагів із сироваткою здорових осіб такого ефекту не виявлено.
Під час інкубації людських та мишачих макрофагів із сироватками крові хворих на ІХС виявлено підвищення вмісту в клітині вільного холестерину та тригліцеридів у 1,5-2 рази, ефірів холестерину у 2,5-3 рази. При цьому. рівень фосфоліпідів не змінювався.
У групі здорових донорів лише у 22 (28%) із 80 осіб сироватки крові викликали акумуляцію холестерину в культурі клітин. У групі хворих на ІХС у 83% осіб сироватки крові викликали достовірне підвищення рівня загального холестерину в макрофагах, тобто мали атерогенні властивості.
Не виявлено кореляції між атерогенністю крові хворих на ІХС та вмістом у сироватці загального холестерину, тригліцеридів, апо-А1, апо-В та ХС ЛПВЩ.
Отримані дані свідчать про наявність прямої кореляції між акумуляцією ліпідів у ГМК та макрофагах, а також про те, що здатність виявляти атерогенність сироватки крові. При використанні перітонеальних макрофагів не відрізняється від даних, отриманих раніше при використанні ГМК інтими аорти. Під час культивування перитонеальні макрофаги акумулюють вільний та естерифікований холестерин, тригліцериди, тобто ті ж ліпіди, які при інкубації включають ГМК інтими аорти. Використання ГМК утруднене через складнощі отримання асептичного матеріалу в достатньому для роботи обсязі. Людські та особливо мишачі макрофаги позбавлені цих недоліків. Ці факти доводять, що культура перитонеальних макрофагів разом із культурою ГМК інтими аорти може бути використана як тест-система для оцінки атерогенного потенціалу сироватки крові.
Макрофаги, можливо, є одним із головних клітинних акцепторів ліпідів у судинній стінці. Давно вже було показано наявність макрофагів, насичених ліпідами, в атеросклеротичних бляшках. Експериментальні роботи, у яких використовувалася культура клітин, виявили здатність макрофагів інтенсивно накопичувати ефіри холестерину при інкубації з хімічно модифікованими ліпопротеїдами.
Використання культури макрофагів дозволить продовжити вивчення природи атерогенності сироватки крові хворих на ІХС та її роль у патогенезі атеросклерозу.
ВПЛИВ ГАМК, ГОМК І ГЛУТАМІНОВОЇ КИСЛОТИ НА ФУНКЦІОНАЛЬНУ АКТИВНІСТЬ ФАГОЦИТІВ
Останніми роками проводиться інтенсивне вивчення ролі нейроактивних амінокислот в імунологічних процесах. Це пов'язано з широким використанням даних амінокислот у неврологічній та психіатричній практиці, проте одночасно з їх прямими ефектами отримані дані про їх вплив на імунологічні процеси. Отримано дані про вплив гамма-аміномасляної (ГАМК), гамма-оксимасляної (ГОМК) та глутамінової кислот на кількість антитілоутворювальних, розеткоутворювальних клітин та інші показники імунітету. Досліди проводилися у двох серіях: у І серії на інтактних мишах вивчався вплив нейроактивних амінокислот на функціональний стан МФ та нейтрофілів. У II серії вплив тих самих речовин на стан фагоцитів вивчалося і натомість попередньої імунізації тварин. Імунізацію проводили 5% суспензією еритроцитів барана в кількості 1 млна 3 день після введення препарату. Контрольну групу становили інтактні миші, які отримували фізіологічний розчин (контроль I), та тварини, які отримували фізіологічний розчин та імунізовані еритроцити барана (контроль II).
Введення інтактним тваринам (I серія) нейроактивних амінокислот супроводжувалося суттєвими зрушеннями активності кислої фосфатази в МФ та нейтрофільних лейкоцитах. Необхідно відзначити, що зміна активності у вивчених групах мала різноспрямований характер. Так, в умовах введення ГАМК активність ферменту в МФ та лейкоцитах крові підвищувалася порівняно з контрольною групою в 1,7 раза, при введенні ГОМК відбувалося достовірне зниження активності кислої фосфатази лише в МФ. Показники активності ферменту при введенні інтактних мишей глутамінової кислоти не відрізнялися від контрольної групи.
Вивчення впливу біологічно активних речовин і натомість попередньої імунізації еритроцитами барана переважають у всіх дослідних групах II серії виявило істотне зниження активності кислої фосфотази в нейтрофильных лейкоцитах. Відносно низькі показники активності в клітинах крові, що вивчаються, були зареєстровані при введенні ГОМК і глутамінової кислоти, які були нижче відповідно в 2 і 1,4 рази контрольного рівня. Активність досліджуваного ферменту МФ дослідних груп II серії не відрізнялася від такої в контролі, за винятком групи, в якій на тлі імунізації вводили ГОМК, де вміст кислої фосфатази знижувалося майже в 2 рази.
У серії проведених цитологічних досліджень було встановлено, що нейроактивні амінокислоти в дозах, що випробовуються, не викликають у клітинах фагоцитарного ряду дистрофічних і деструктивних змін. Так, в жодній досліджуваній групі I серії не було виявлено ознак розпаду, фрагментації та лізису цитоплазмічної та ядерної мембран, пікнозу і рексису ядер. У той же час у групах, де вводили ГАМК і ГОМК, ядра моноцитів виглядали гіпертрофованими та гіпохромними, цитоплазма-помірковано вакуолізованою. Не виключено, що нейроактивні амінокислоти в біологічно допустимих дозах не мають цитотоксичного впливу на моноцити та нейтрофільні лейкоцити в крові інтактних мишей. Однак суттєві зрушення в активності основного маркера лізосом-кислої фосфатази наводять на думку, що біологічно активні речовини, що вивчаються, не надаючи безпосереднього токсичного дії на клітинну мембрану, викликають все-таки дестабілізацію внутрішньоклітинних мембранних структур, і, в першу чергу, лізосомальних. Беручи до уваги та обставина, що активність лізосомальних ферментів багато в чому залежить від функціонального стану мембран, а точніше від ступеня її проникності, була проведена спеціальна серія експериментів з вивчення проникності лізосомальних мембран за допомогою прижиттєвого флюорохромування фагоцитів акридиновим помаранчевим (АТ). Результати досліджень із застосуванням АТ показали, що зміна тинкторіальних властивостей клітин-мішеней спостерігалася при введенні в організм мишей усіх досліджуваних нейроактивних амінокислот. При введенні ГАМК, ГОМК та глутамінової кислоти період напіврозпаду (Т 1/2) помітно скорочується, а при експозиції Т "/а, протягом якого відбувається поетапна зміна тинкторнальних властивостей складових компонентів клітин (цитоплазма, ядро, ділянки локалізації лізосом), кількість фагоцитів з зеленою флюоресценцією ядер у досвідчених групах І серії достовірно знижувалося.
Резюмуючи вищевикладене, можна зробити висновок, що нейроактивні амінокислоти істотно впливають на активність кислої фосфатази у фагоцитах. Особливо слід зазначити, що отриманий ефект у групах введення ГАМК та ГОМК був діаметрально протилежним: цей факт простежується найбільш чітко в тих випадках, коли як об'єкт вивчення активності кислої фосфатази виступали МФ. Введення ГАМК і глутамінової кислоти на тлі попередньої імунізації не відбивалося на активності кислої фосфатази в МФ, в той час як в нейтрофільних лейкоцитах всі нейроактивні амінокислоти, що вивчаються, викликали достовірне зниження активності ферменту.
Експерименти із застосуванням як індикатора проникності лізосомальних мембран АТ показали, що нейроактнвние амінокислоти, не володіючи цитодеструктивною дією па клітини-мішені, викликають дестабілізацію лізосомальних мембран, спрямовану у бік збільшення їх проникності. Зіставлення показників проникності лізосомальних мембран тварин І та ІІ серій показує, що для підвищення проникності під впливом нейроактивних амінокислот формування гуморального імунітету є умовою необов'язковою.
Таким чином, нейроактивні амінокислоти мають вибірковий вплив на морфофункціональний стан лізосомального апарату фагоцитів. Це підтверджується отриманими даними про проникність лізосомальних мембран щодо токсичного барвника та кількісного визначення активності основного маркера лізосом – кислої фосфотази.
IV. Висновок
Наведена лише мала частина експериментів з моделювання різних впливів говорить на користь того, що процеси порушень або зміни фагоцитуючої активності дуже зручно вивчати шляхом постановки дослідів на перитонеальних МФ. Можна сказати, що дана модель давно стала базовою для перевірки різноманітних хімічних та фармакологічних препаратів як агентів, що впливають на клітинну ланку імунітету; вивчення процесів взаємодії інфекційних агентів з фагоцитами. Також вона використовується для вивчення не лише фагоцитарної функції – а й навпаки, різних процесів, пов'язаних із самими інфекційними агентами. Можна згадати, що проводяться дослідження з вивчення фагоцитів перитонеального ексудату у генетично діабетичних мишей, генетично імунодепресивних щурів і т.д.
Звичайно ті дані, які отримують дослідники досить відносні, адже незважаючи на високу якість проведених дослідів, вони все ж таки проводяться in vitro,що незмінно накладає свій відбиток – клітини тут позбавлені тієї гами цитокінових впливів, що є у живому організмі, де вони взаємодіють із стромальними компонентами та інші клітинами. Достоїнством методу є його простота, доступність і, що важливо, наочність, а також висока швидкість отримання результатів та широкі можливості щодо постановки “реєстраційних” реакцій. Проте, очевидно, цим у сучасній патології ми можемо обмежитися. Тому в сучасних наукових та клінічних дослідженнях застосовують й інші методи та моделі. Про деяких із них коротко буде розказано нижче.
ДЕЯКІ ІНШІ МОДЕЛІ ВИВЧЕННЯ ФАГОЦИТОЗУ.
- Одна з реалістичних моделей фагоцитозу - це модель in vivo.Ця модель дозволяє отримувати достовірну інформацію та моделювати процеси з урахуванням впливу внутрішнього середовища. Однак вона складніша в реалізації і часом не дає можливості працювати з організмом людини. Модель in vivoіснує у двох варіантах
- Модель на фагоцитах сироватки. Звичайно, у цьому випадку об'єктом нашої уваги будуть не МФ, а моноцити крові та нейтрофільні лейкоцити. Модель дозволяє вивчати вплив на стан фагоцитів та фагоцитарної функції загальних, системних процесів, таких як гіпоксія, гіпобарія, радіація та ін. Також шляхом внутрішньосудинного введення різних речовин можна отримати дані про їх вплив. Вивчається вплив і внутрішніх системних активних речовин: гістаміну, простогландинів
- Модель фагоцитозу у вогнищі хронічного запалення. Одна з самих "клінічних" моделей. Тут об'єктом уваги є як тканинні МФ, так і епітеліоїдні клітини, гігантські багатоядерні клітини, клітини сторонніх тіл та ін. Велика увага приділяється явищу незавершеного фагоцитозу, процесів придушення міграції, зниження кисню залежної цитотоксичності.
- Дуже оригінальна модель була розроблена у лабораторії імунології Інституту акушерства та гінекології ім. Отта РАМН (автори: О.А.Павлов, С.А.Сельков, А.В.Селютін, Є.Є.Андрєєва та ін). Вони вивчали роль плацентарних МФ у проблемах родової діяльності та, особливо – у проблемі невиношування вагітності. Макрофагам фетоплацсптарного комплексу (МФК), на думку дослідників, донедавна приділялося невиправдано мало уваги. Лише останніми роками з'явилася низка публікацій, присвячених цим клітинам. Багато функцій МФК тільки слід з'ясувати, проте вже зараз стає очевидним, що серед популяцій різних клітин, що становлять тканину плаценти, МФК є найбільш ймовірними кандидатами на роль регуляторної (а, можливо, і ключової) ланки в ряді репродуктивних процесів. З точки зору патогенезу розвитку родової діяльності при передчасних і термінових пологах МФК становлять особливий інтерес через особливості ряду властивостей і положення цих клітин.
Плацентарні макрофаги (клітини Кащенко-Гофбауера) належать до системи мононуклеарпих фагоцитів, що мають єдине походження із звичайними МФ. Ці клітини у значній кількості містяться в тканині плаценти і становлять переважну більшість її імунокомпетентних клітин. За даними деяких авторів, макрофаги становлять до 40% популяції нетрофобластних клітин ворсин хоріону.
Традиційно вважалося, що прерогативою мононуклеарних фагоцитів у фетоплацентарному комплексі є видалення клітинного детриту, захист від мікроорганізмів, участь у системі захисту плода місцевої материнської імунної відповіді. Вони також беруть участь у реалізації та модуляції імунної відповіді та представляють першу лінію захисту проти інфекції, забезпечуючи неспецифічні імунні реакції та продукуючи регуляторні сигнали для специфічних. Таким чином, унікальність положення МФК полягає в тому, що, з одного боку, вони як ефекторні клітини вступають у безпосередній контакт з інфекційними агентами та іншими продуктами, що проникають в організм господаря (в даному випадку в єдину систему "матір-плацента-плід"). "), а з іншого боку, будучи активованими в результаті цього контакту, здатні продукувати безліч розчинних сигнальних молекул, що впливають на функції прилеглих клітин.
До цих факторів входять і цитокіни, зміст яких змінюється з початком спонтанної родової діяльності - ФНПа, ІЛ-1, ІЛ-6 та ІЛ-8. Передбачається, що ці цитокіни, які продукуються макрофагами, стимулюють синтез ПГ і тим самим ініціюють скорочувальну активність матки. Понад те, показано, що макрофаги можуть самостійно продукувати ПГЕ2 ПГ2а, які безпосередньо впливають на міометрій. Макрофаги також здатні до секреції трансформуючого ростового фактора-β (ТРФ-β), який відіграє важливу роль в ембріональному морфогенезі та впливає на функції клітин трофобласту та ендометрію. Нещодавно в експериментах in vitroотримані переконливі докази участі клітин плаценти у процесі пологів. Автори продемонстрували пов'язане з родовою діяльністю збільшення секреції ФНП-α макрофагами, взятих у жінок в результаті спонтанних пологів або індукованих пологів шляхом штучно розродження, а також ІЛ-1 та ІЛ-6 ендотеліальними клітинами плаценти. Всі ці дані свідчать про вклад клітин плаценти, у тому числі макрофагів, у підвищення рівня цитокінів у межах фетоплацентарного комплексу при спонтанній родовій діяльності. Припущення про можливу роль ПМ у передчасному та терміновому розродженні змушують поглянути на цю клітинну популяцію як на найважливіший елемент, що впливає на гестаційні процеси. У зв'язку з цим активація ПМ може розглядатися як подія, що веде до передчасних або термінових пологів. Встановлено позитивну кореляцію між підвищенням рівня деяких цитокінів (туморнекротизуючий фактор-α, інтерлейкін-1 та -6), які секретуються у тому числі активованими макрофагами, та настанням передчасних та термінових пологів. Спробували виявити зв'язок між наявністю пологової діяльності на різних термінах вагітності та ступенем активації ПМ in vitro, проякої судили за рівнем експресії антигенів МНС II та фагоцитарної активності клітин, опосередкованої Fс- та СЗ-рецепторами. за наявності родової діяльності. Збільшувалася кількість клітин, що експресують МНС II і СКЗ і мають здатність до фагоцитозу. На пізніших термінах вагітності не вдалося виявити достовірного збільшення активності ПМ під час пологової діяльності. Згідно з даними, зниження рівня фагоцитозу відбувалося за рахунок зниження активності окремої клітини, у той час як кількість фагоцитів істотно не змінювалася. Для того, щоб з'ясувати, чи відображає тенденція, що спостерігається, існуючу закономірність, чи є наслідком неоднорідності досліджуваного матеріалу, необхідно дослідити додаткову кількість плацент.
Отримані результати свідчать про перспективність застосування збагачених культур ПМ для вивчення низки аспектів імунології репродукції, зокрема для з'ясування клітинних механізмів, що лежать в основі нормальних та передчасних пологів.
Література
- Д.І. Маянський, Клітина Купфера та система мононуклеарних фагоцитів, Москва, 1983
- Методи вивчення in vitro клітинного імунітету, за ред. Блума та Глейда, Москва,1974
- І.І.Мечников, Лекції з порівняльної патології запалення, Москва, 1947
- Терапевтичний архів, 1990, Т62, N11
- Питання медичної хімії, 1988, Т34, Вип.1
- Лабораторна справа, 1984, N5
- Лабораторна справа, 1985, N1
- Лабораторна справа, 1992, N2
- Лабораторна справа, 1989, N4
- Імунологія, 1983, N1
- Імунологія, 1983, N2
- Імунологія, 1987, N6
- Імунологія, 1989, N4
- Імунологія, 1999, N1
- Бюлетень експериментальної біології та медицини, 1988, N1
- Бюлетень експериментальної біології та медицини, 1989, N11
- Бюлетень експериментальної біології та медицини, 1990, N1
- Бюлетень експериментальної біології та медицини, 2000, Т129, N6
- Бюлетень експериментальної біології та медицини, 1999, Т127, N4
- Журнал мікробіології епідеміології та імунобіології 1990, N5
- Архів патології, 1994, Т56, N1
- Медична імунологія, 2001, Т3, N3
- Експериментальна та клінічна медицина, 1989, Т29, N3
- Експериментальна та клінічна медицина, 1989, Т29, N6
- Цитологія, 1992, Т34, N7
1 ГБОУ ВПО «Московський державний медико-стоматологічний університет» Міністерства охорони здоров'я та соціального розвитку Російської Федерації, Москва
2 УРАМН НДІ загальної патології та патофізіології РАМН, Москва
Значну роль ініціації та розвитку запальних реакцій у легенях грають альвеолярні макрофаги – одні з центральних клітин системи вродженого імунітету. Важливими компонентами вродженої відповіді є здатність макрофагів до фагоцитування та їх міграційна активність. Альвеолярні макрофаги прозапального М1 фенотипу, виділені від мишей лінії С57/BL6, мають більшу фагоцитарну активність по відношенню до S.aureus порівняно з виділеними від мишей лінії BALB/c альвеолярними макрофагами антизапального М2 фенотипу. При порівняльному аналізі міграційної активності встановлено альтернативну залежність показника активності від типу використовуваного хемоаттрактанта.
макрофаги
фенотипи макрофагів
фагоцитоз
міграційна активність
1. Macrophage phenotype як визначальний біологічний кафold remodeling / S.F. Badylak, J.E. Valentin, A.K. Ravindra та ін. // Tissue Eng Part A. - 2008. - Vol. 14. Issue 11. - P. 1835-42.
2. Benoit M., Desnues B., Mege J.L. Macrophage Polarization in Bacterial Infections // The Journal of Immunology. - 2008. - Vol. 181. - P. 3733-3739.
3. Cairo G., Locati M., Mantovani A. Керівництво героїчної homeostasis є key component of macrophage polarization // Haematologica. - 2010. - Vol 95, Issue 11. - P. 1801-1803.
4. Pulmonary Immunobiology and Inflammation в Pulmonary Diseases. NHLBI Workshop Summary/D. Crapo, A.G. Harmsen, M.P. Sherman, R.A. Musson // Am J Respir Crit Care Med. - 2000. - Vol. 162. - P. 1983-1986.
5. Frevert, Wong, Goodman та ін. Rapid Fluorescence-базований Measurement of Neutrophil Migration in Vitro // Journal of Immunological Methods. - 1998. - Vol. 213. - P. 41-52.
6. Goldmann O., von Köckritz-Blickwede M., Höltje C. et al. Transcriptome Analysis of Murine Macrophages in Response to Infection with Streptococcus pyogenes Reveals unusual Activation Program // Infect Immun. - 2007. - Vol. 75, Issue 8. - P. 4148-57.
7. Lasbury, M.E., Durant P.J., Lee C.H. Microbiol. - 2003. - Vol. 50(Suppl). - P. 637-638.
8. Lay J.C., Alexis N.E., Zeman K.L., et al. In-vivo Uptake Inhaled Particles by Airway Phagocytes is Enhanced in Mild Asthmatics Compared to Normal Volunteers // Thorax. - 2009. - Vol. 64. - P. 313-320.
9. Martinez F.O., Sica A., Mantovani A. та ін. Macrophage activation and polarization // Front Biosci. - 2008. - Vol. 13. - P. 453-61.
10. Platt N., Haworth R., da Silva R.P., Gordon S. Scavenger receptors and phagocytosis of bacteria and apoptotic cells // Advances in Cellular and Molecular Biology of Membranes and Organelles. - 1999. - Vol. 5. - P. 71-85.
11. Stangel M., Joly E., Scolding NJ, Compston D.A.S. Normal polyclonal immunoglobulins ('IVIg') inhibit microglial phagocytosis in vitro // Journal of Neuroimmunology. - 2000. - Vol. 106(1). – P. 137–144
12. Tumitan A.R., Monnazzi L.G., Ghiraldi F.R. та ін. Потужність makrophage activation в йерсінія-зав'язка і йерсінія-супутні білки mice // Microbiol Immunol. - 2007. - Vol. 51(10). – P. 1021–8.
Запальні реакції відіграють винятково важливу роль у розвитку великої кількості захворювань легень, таких як бронхіальна астма, гострий респіраторний дисстресс синдром та бронхолегенева дисплазія. Відомо, що одну з центральних ролей в ініціації та розвитку запальних реакцій у легенях відіграють альвеолярні макрофаги. При активації ці клітини продукують вільні радикали, NO, цитокіни, кемокіни та інші медіатори запалення і завдяки цьому запускають вроджену та адаптивну імунну відповідь і знешкоджують патогенні мікроби.
У ході імунної відповіді нативні макрофаги можуть набувати різних функціональних фенотипів. Так, класичний М1 фенотип характеризується продукцією прозапальних цитокінів і кемокінів, таких як TNF-α, IL-1ß, IL-6, IL-12, запального білка макрофагів 1α (MIP-1α), а також підвищеною генерацією оксиду азоту (NO). М1 макрофаги є ефекторними клітинами, які інтегровані в Th1 відповідь. Цей фенотип вбиває мікроорганізми та пухлинні клітини та продукує великі кількості прозапальних цитокінів. Альтернативний М2 фенотип макрофагів характеризується продукцією антизапальних цитокінів, таких як IL-10 та рецептор-пастки IL-1 (IL-1ra). Функціональне призначення М2 фенотипу полягає насамперед у регулюванні запальної відповіді, участі в ангіогенезі, ремоделюванні тканин та відновленні імунного гомеостазу, порушеного запаленням.
Очевидно, що ефективність, з якою вроджений імунітет видалятиме патогенні мікроби і при необхідності стимулювати ангіогенез, ремоделювання та відновлення пошкоджених тканин, істотно залежить від фагоцитарної активності макрофагів, і від того, як швидко ці клітини можуть приходити в осередок запалення, тобто. від їх міграційної активності.
Таким чином, здатність до фагоцитування та міграційна активність макрофагів складають важливі компоненти вродженої відповіді, від якої залежить, як швидко імунна система зможе відновити гомеостаз, порушений появою інфекції та пошкодженням тканин. Однак досі важливе питання про те, які відмінності фагоцитарної здатності та міграційної активності М1 та М2 фенотипів макрофагів залишається відкритим.
Мета цієї роботи полягала у тому, щоб відповісти це питання.
Матеріали та методи дослідження
Миші
Для вивчення функціональних відповідей (визначення фагоцитарної та міграційної активності) виділення альвеолярних макрофагів проводилося у мишей різних ліній. Відомо, різні генетичні лінії тварин можуть мати різні фенотипи макрофагів. Наприклад, миші лінії С57/BL6 мають фенотип М1, тоді як миші Balb/c - М2 фенотип . Миші ліній С57/BL6 і Balb/c були отримані з віварію ГБОУ ВПО МДМСУ МОЗсоцрозвитку Росії, Москва, Росія. Для досліджень використовувалися самці обох ліній, вік 10-12 тижнів, масою 23-28 р. Дослідження проводилися відповідно до правил належної лабораторної практики (GLP). Миші містилися в умовах віварію, що не допускають потрапляння патогенних мікроорганізмів.
Виділення альвеолярних макрофагів
Альвеолярні макрофаги виділялися із бронхоальвеолярного лаважу (БАЛ) мишей. Попередньо мишам внутрішньочеревно вводився розчин хлоралгідрату (з розрахунку 32,5 нг на 100 г ваги тварини), згодом миші умертвлялися за допомогою перерізання нижньої порожнистої вени та знекровлення. Для отримання бронхо-альвеолярного лаважу (БАЛ) у легені через внутрішньотрахеальний катетер вводилося по 1 мл стерильного фосфатного буфера PBS 37 ° С (у кожної тварини виконувалось по 4 промивання). Отриманий БАЛ центрифугувався при 1000 об/хв 4 хв. Клітинний осад ресуспендували в 3 мл середовища RPMI 1640 з подальшим визначенням кількості макрофагів у камері Горяєва та доведенням концентрації клітин у середовищі RPMI 1640 до 1106/мл.
Визначення фагоцитарної активності альвеолярних макрофагів
Визначення фагоцитарної активності макрофагів проводилося на суспензії клітин, отриманих з бронхо-альвеолярного лаважу за методикою, зазначеною вище. Як об'єкт фагоцитозу використовували інактивований нагріванням штам Staphylococcus aureus 9198. Бактеріальну суспензію готували з добової культури вбитих прогріванням при температурі 56 °С протягом 1 години мікроорганізмів з подальшим триразовим відмиванням у стерильному фізіолог. За стандартним зразком каламутності ВЗО 42-28-85П 10 одиниць (ГІБК ім. Л.А. Тарасевича) визначали концентрацію бактеріальних клітин, доводячи до 1∙10 9 /мл. У промарковані лунки 24-лункового планшета вносили макрофаги в середовищі RPMI 1640 з концентрацією 1∙10 6 /мл та Staphylococcus aureus 9198 (концентрація мікроорганізмів у підготовленого штаму становить 1∙10 9 /мл) у співвідношенні макрофаги; 1:600; 1:800; 1:1000) до загального обсягу 1 мл/лунка. Планшет з макрофагами та мікроорганізмами інкубували протягом 3 годин при температурі 37 ± 0,5 °С при 5 % 2 . Через 3 години лунки планшета промивали розчином Хенкса (+ 4 °С), висушувалися при кімнатній температурі протягом 30 хвилин з наступною фіксацією абсолютним етиловим спиртом та фарбою по Романівському-Гімзі. Фагоцитарна функція макрофагів оцінювалася прямим візуальним підрахунком поглинених бактерій. При використанні прямого візуального методу розраховувався фагоцитарний індекс (ФІ) - відсоток клітин фагоциту від загального числа і фагоцитарне число (ФЛ) - середня кількість мікробів, захоплених однією клітиною (оцінювалося тільки для фагоцитуючих клітин).
Визначення міграційної активності макрофагів
Визначення міграційної активності макрофагів проводилося на суспензії клітин, отриманих з бронхо-альвеолярного лаважу за методикою, зазначеною вище, ресуспендованих в хемотаксичному середовищі (RPMI без фенолового червоного 96 мл, 1М HEPES - 1 мл, 7,0 % NaHCO 3 L-глутамін – 1 мл, BSA – 0,5 г).
В основі методики визначення міграційної активності альвеолярних макрофагів лежить принцип методу Бойдена, заснований на проходженні лейкоцитів з однієї половини камери із суспензією клітин в іншу половину камери, що містить хемоатрактант, та розділених між собою мембранним фільтром. Аналіз хемотаксису проводився безпосередньо за методикою Neuro Probe Protocol.
У нижні промарковані мікроосередки камери вносили по 30 мкл хемоаттрактанта (використовували БАЛ мишей лінії С57/BL6 і Balb/c), поміщали фільтр з діаметром пор 8 мкм, камеру закривали і у верхні мікроосередки камери вносили по 100 мкл суспензії клітин 106/мл) у хемотаксичному середовищі. Заповнену камеру інкубували протягом 3 годин при температурі 37±0,5°З 5% СО2. Через 3 години з верхніх осередків камери проводилася аспірація клітин, комірки заповнювалися 2 мМ ЕДТА в 1 PBS на 15 хвилин з подальшою аспірацією ЕДТА. Камеру відкривали і клітини з верхньої сторони мембрани видаляли за допомогою Q-наконечника. Потім мембрану центрифугували при 1500 g 15 хвилин (+4 °С). Фарбування мембрани проводили азур-еозином за Романовським протягом 15 хвилин. Підрахунок кількості клітин, що мігрували, проводився в кожному осередку під оптичним мікроскопом.
Для оцінки міграційної активності нами був використаний індекс міграції - відношення кількості клітин, що мігрували, до кількості немігрованих в одній лунці.
Результати дослідження та їх обговорення
На малюнку представлені дані фагоцитарної активності макрофагів двох фенотипів залежно від співвідношення кількості бактерій однією макрофаг.
Порівняльна оцінка фагоцитарної активності макрофагів М1 фенотипу, виділених
з мишей лінії С57 та макрофагів М2 фенотипу, виділених з мишей лінії BABL/c
Видно, що з усіх співвідношеннях середня кількість бактерій, поглинених одним М1 макрофагом, було достовірно більше, ніж у М2 макрофагів. Це означає, що фенотип М1 більш ефективно фагоцитує S.аureus, ніж М2 фенотип. При цьому фагоцитарна активність фенотипу М1 більше залежала від концентрації S. Aureus, ніж у фенотипу М2. На графіці це відбивається у крутішому підйомі кривої М1, проти М2.
Далі в таблиці представлені дані про міграційну рухливість макрофагів М1 і М2 фенотипів у відповідь на два різні типи хемоаттрактантів: БАЛ, виділений з мишей лінії BALB/c (БАЛ BALB/c), та БАЛ із С57 (БАЛ С57).
Порівняльна оцінка міграційної активності макрофагів М1 фенотипу, виділених з мишей лінії С57, та макрофагів М2 фенотипу, виділених з мишей лінії BABL/c. Міграційна активність кількісно оцінювалася за міграційним індексом, представленим як співвідношення кількості клітин, що мігрували, до немігрованих
Ці дані дозволяють зробити кілька важливих висновків.
По-перше, порівняльна оцінка міграційної рухливості М1 і М2 фенотипів альтернативно відрізняється залежно від того, який тип хемоаттрактанта-БАЛ був використаний. Дійсно, у випадку, коли в якості хемоаттрактанту використовується БАЛ BALB/c активність макрофагів М2 істотно вище, порівняно з М1 (1,88 ± 0,13 vs 1,12 ± 0,12, р< 0,01). В том же случае, когда в качестве хемоаттрактанта используется БАЛ С57 , активность макрофагов М1 существенно выше, по сравнению с М2 (1,50+0,11 vs 0,93 ± 0,12, р < 0,01).
По-друге, міграційна активність М2 макрофагів, виділених з мишей BALB/c у відповідь на «рідний» БАЛ BALB/c , достовірно вища, ніж активність М1 макрофагів, виділених з мишей С57 у відповідь на свій «рідний» БАЛ С57 (1, 88 ± 0,13 vs 1,50 ± 0,11, р< 0,05).
По-третє, міграційний рух макрофагів на свій «рідний» БАЛ значно вищий, ніж на «чужорідний» БАЛ. Так, міграційна активність макрофагів М2 фенотипу, виділених з мишей BALB/c у відповідь на свій БАЛBALB/c, була вдвічі вищою, ніж на чужорідний БАЛС57 (1,88 ± 0,13 vs 0,93 ± 0,12, р< 0,001). Аналогичным образом, миграционная активность макрофагов М1 фенотипа, выделенных из мышей С57 в ответ на свой БАЛС57, была почти в полтора раза выше, чем на чужеродный БАЛBALB/c (1,50 ± 0,11 vs 1,12 ± 0,12, р < 0,05).
Результат того, що макрофаги М1 фенотипу, виділені від мишей С57, мають більшу фагоцитарну активність по відношенню до S.aureus, порівняно з макрофагами М2 фенотипом, виділеними від мишей BALB/c, є цілком передбачуваним. Ймовірно, значною мірою це пов'язано з тим, що макрофаги М1 імунологічно «орієнтовані» на захоплення внутрішньоклітинних мікробів, таких як бактерії та віруси, і вони, порівняно з М2 фенотипом, мають більше представництво мікробних патерн-розпізнаючих рецепторів фагоцитозу.
М2 фенотип бере участь у ремоделюванні та відновленні пошкоджених тканин , тому більше «орієнтований» на захоплення мертвих фрагментів загиблих клітин або сторонніх неживих частин-
чек. Тому не виключено, що при використанні замість S.aureus, наприклад, частинок фарби або латексних кульок, фагоцитоз М2 фенотипу буде більш ефективним порівняно з М1. Підтвердження цьому справді є у літературі. Так показано, що стосовно латексних кульок і частинок зимозану фагоцитоз М2 фенотипу був більш ефективний, порівняно з М1 фенотипом.
Таким чином, порівняльний висновок про фагоцитарну активність різних фенотипів макрофагів повинен завжди враховувати природу агента, що фагоцитується: бактерії, частинки фарби, або мертві фрагменти клітин. У нашому випадку щодо S.aureus фагоцитарна активність М1 фенотипу була суттєво вищою, порівняно з М2 фенотипом макрофагів.
При порівняльному аналізі міграційної активності складається аналогічна ситуація, саме, наші дані показали, що порівняльна оцінка альтернативно залежить від типу використовуваного хемоаттрактанта. Очевидно, що з'ясування причин такої залежності вимагатиме докладної розшифровки складу хемоаттрактантних молекул у двох типах БАЛ та відповідь на питання, які відмінності між БАЛBALB/c та БАЛС57 щодо вмісту хемоаттрактантних кемокінів, цитокінів, сурфактантних білків та ін.
Очевидно, що в наших умовах міграційна активність макрофагів залежала від двох факторів:
1) власна спроможність макрофага того чи іншого фенотипу до руху;
2) концентрація та потужність хемоаттрактантних молекул у тому чи іншому БАЛ.
Тому при порівняльній оцінці міграційної активності різних фенотипів макрофагів, виділених із різних ліній тварин, доцільно використовувати інтегральний підхід, тобто оцінювати міграційну активність макрофагів у своїх природних умовах свого БАЛ. При такому підході виявилося, що міграційна активність М2 макрофагів мишей BALB/c виявилася достовірно вищою за таку для М1 макрофагів мишей С57.
І, нарешті, також заслуговує на увагу ще один цікавий факт, що міграційна активність і М1, і М2 фенотипів істотно знижувалася у відповідь на чужорідний БАЛ. Це здається дивним, тому що макрофаг є саме та клітина імунної системи, яку «чужорідне» має залучати набагато сильніше, ніж «своє». Для відповіді це питання також необхідно проаналізувати хімічний і молекулярний склад БАЛ мишей різних ліній.
У цілому нині наші результати показали, що фагоцитарна і міграційна активність М1 і М2 фенотипів макрофагів істотно різниться, проте висновок спрямованості цих відмінностей необхідно робити з урахуванням конкретних умов прояву цих активностей.
Рецензенти:
Чеснокова Н.П., д.м.н., професор, професор кафедри патологічної фізіології ДБОУ ВПО «Саратовський державний медичний університет ім. В.І. Розумовського» Міністерства охорони здоров'я та соціального розвитку РФ, м. Саратов;
Архипенко Ю.В., д.б.н., професор, зав. лабораторією адаптаційної медицини факультету фундаментальної медицини МДУ ім. М.В. Ломоносова, м. Москва.
Робота надійшла до редакції 10.11.2011.
Бібліографічне посилання
Ляміна С.В., Веденікін Т.Ю., Круглов С.В., Шимшелашвілі Ш.Л., Буданова О.П., Малишев І.Ю., Малишев І.Ю. ОСОБЛИВОСТІ ФАГОЦИТАРНОЇ ТА МІГРАЦІЙНОЇ АКТИВНОСТІ АЛЬВЕОЛЯРНИХ МАКРОФАГІВ М1 І М2 ФЕНОТИПІВ // Фундаментальні дослідження. - 2011. - № 11-3. - С. 536-539;URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29267 (дата звернення: 13.12.2019). Пропонуємо до вашої уваги журнали, що видаються у видавництві «Академія Природознавства»
Одна з причин, чому рак так важко лікувати, що він уникає виявлення організмом. Агенти імунної системи постійно перевіряють поверхні клітин на хімічні сигнали, що підтверджують їхню приналежність, але ракові клітини посилають ті ж хімічні сигнали, що і здорові.
Тепер дослідники з Університету Пенсільванської школи навчилися реорганізовувати макрофаги, «перші відповідачі» імунної системи, щоб вони могли розрізняти здорові та ракові клітини.
Сконструйовані клітини повинні циркулювати через тіло миші, вторгатися в пухлини та поглинати ракові клітини людини у ній. Це є потенційний прогрес у галузі імунотерапії раку, який досі досяг найбільшого успіху в лікуванні «рідких» пухлин, пов'язаних з раком крові.
Імунні клітини, які називають макрофагами, є першими відповідачами організму; Вони видаляють хворі чи чужорідні клітини з організму, пожираючи та перетравлюючи їх. Макрофаги також повинні руйнувати ракові клітини, але вони виникають зі здорових клітин, які перші захищаються майже всіма тими самими механізмами, що перешкоджають нападу імунної системи.
Лабораторія Discher має знання, що імітують ці захисні механізми на здорових клітинах, але тепер вони націлюються на білки макрофагів, які реагують на ці сигнали.
«Наш новий підхід залучає молоді та агресивні макрофаги з кісткового мозку людини-донора та усуває гарантію того, що ракові клітини кооптовані, щоб запобігти їх зараженню», — сказав Алвей. «У поєднанні з антитілами, орієнтованими на рак, ці сконструйовані макрофаги впроваджуються в тверді пухлини і швидко призводять до регресії пухлин людини без будь-якої вимірної токсичності».
Терапія імунних клітин із використанням штучних Т-клітин останнім часом стала успішним лікуванням деяких видів раку крові, які називаються «рідкими» пухлинами. Пухлини в інших тканинах зазвичай більш жорсткі, що може фізично перешкоджати здатності Т-клітин проникати в масу пухлини.
Макрофаги легко проникають у уражені та пошкоджені тканини, включаючи пухлини. Таким чином, терапія раку на основі макрофагів була досліджена десятиліття тому. Хоча вони виявилися безпечними у пацієнтів, вони не були ефективними у знищенні ракових клітин. Тепер зрозуміло, що такі макрофаги отримали той самий сигнал «не їж мене» як зі здорових, так і з ракових клітин.
Лабораторія Discher з того часу показала, що білок на людських клітинах, званий CD47, функціонує як "маркер себе", взаємодіючи з білком на поверхні макрофагів SIRPA. Коли SIRPA контактує з CD47 на будь-якій іншій клітині, він є захистом, який запобігає поглинанню макрофагом іншої клітини, навіть якщо вона ракова. Дослідники вважали, що контроль цього білка може пожвавити клітинні терапії з урахуванням макрофагів.
Ін'єкції молекул антитіл, які блокують CD47 від взаємодії з SIRPA, вже пробують у клініці, ґрунтуючись на спостереженнях за деяким зменшенням розмірів пухлин у мишей. Однак такі молекулярні методи лікування відтворено викликають швидку втрату багатьох циркулюючих клітин крові, оскільки макрофаги також атакують деякі здорові клітини. На додаток до виникнення анемії деякі миші з виснаженим CD47 помирають від аутоімунного захворювання.
Щоб обійти ці проблеми безпеки та потенційно максимізувати терапевтичний вплив на пухлини, Елві та його колеги взяли молоді молочні макрофаги від донорів, а також мишей та безпосередньо заблокували їх SIRPA. Вони також вводили різні антитіла, які зв'язуються з раковими клітинами, які допомагають активувати макрофаги, які можуть проникати в пухлину.
"Великий сюрприз, - сказав Дискер, - полягає в тому, що ін'єктовані макрофаги циркулюють по всьому тілу, але накопичуються тільки всередині пухлин, де вони зачіплюються за ракові клітини".
Після двох ін'єкцій ракові клітини були очищені у 100 разів від пухлин розміром десять центів, а пухлини зменшилися на 80 відсотків. Важливо, що у кров'яні клітини не вплинули процедури, що передбачає, що такий підхід безпечний.
"Безпека досі, ймовірно, є наслідком як відносно невеликої кількості макрофагів, що інжектуються, так і їх секвестрації в пухлини, далеко від більшості здорових клітин", - сказав Дискер.
Дослідження виявило нові біологічні механізми, у тому числі спостереження, що ін'єктовані макрофаги, які накопичуються в пухлинах, перестають проникати у ракові клітини приблизно за тиждень. Подальші ін'єкції проте безпечно призводять до регресії пухлини.
"Перша фаза клінічних випробувань - це випробування безпеки людини, тому це перспективний початок", - сказав Алві. «Ефективність цих сконструйованих макрофагів щодо зрозуміла, але ключова проблема полягає в тому, як максимізувати протиракові ефекти, одночасно зменшуючи побічні ефекти, а саме поглинання нормальних клітин».
Поточні дослідження в лабораторії Discher зосереджені на тому, як створити макрофаги для більш тривалої дії.
