Реакция связывания комплемента (РСК) основана на том, что специфический комплекс антиген - антитело все­гда адсорбирует на себе (связывает) комплемент.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов и в серодиагностике инфекций особенно забо­леваний* вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиямй и вирусами.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней уча­ствуют комплемент и две системы антиген - антитело. По существу, это две серологические реакции.

Первая система - о с н о в н а я состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодис­персный и не виден.

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикатор­ной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответ­ствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т. е. готовый, иммунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой (при соответствии в ней антигена и антитела), то во второй системе гемолиза не будет - так как нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержи­мое пробирки мутное или на дне ее осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то иммунный комплекс не образуется и компле­мент останется свободным! Оставшийся свободным, ком­племент участвует во второй системе, вызывая гемолиз,- результат РСК отрицательный (содержимое пробирок прозрачно - «лаковая кровь»).

Компоненты реакции связывания комплемента:

Антиген - обычно лизат, экстракт, гаптен; реже взвесь.

1.Антитело-сыворотка больного система
2. Комплемент - сыворотка морских свинок

3.Антиген - эритроциты барана

4.Антитело - гемолизин к эритроцитам барана

5.Изотонический раствор

Ввиду того что в РСК участвует большое количество сложныхкомпонентов, они должны быть предварительно оттитрованы ивзяты в реакцию в точных количествах и в равных объемах: по 0,5или 0,25, реже по 0,2 мл. Соответственно весь опыт проводят вобъемах 2,5, 1,25 или 1,0 мл (большие объемы дают болееточный резуль­тат). Титрование компонентов реакции проводят втом же объеме, в каком ставят опыт, заменяя недостающиеингредиенты изотоническим раствором.

Подготовка ингредиентов

Гемолитическая сыворотка (гемолизин). Сыворотку разводят 3 раза меньше ее титра (см. с. 211). Готовят общее разведение сыворотки для всего опыта, объем которого определяют, умножив объем сыворотки в одной пробирке (например, 0,5 мл) на число пробирок, немного превышающее число их в опыте.

2.Эритроциты барана. Готовят 3% взвесь отмытых эритроцитов барана (см. с. 211) на все количество пробирок в опыте. Для приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт смешивают равные объемы разведенного гемолизина и взвеси эритроцитов, приливая сыворотку к эритроцитам, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37˚С.

3.Комплемент обычно разводят 1:10. перед каждым опытом его обязательно титруют. Титр комплемента – это его наименьшее количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1ч при 37˚С. Схеме титрования комплемента представлена в таблице 21.

Внимание! Титруют комплимент в таком же объеме, в каком ставят основной опыт, заменяя изотоническим раствором недостающие ингредиенты.

Учет результатов. В контролях не должно быть даже следов гемолиза, так как в одном из них нет комплемента, в другом – гемолизина. Контроли свидетельствуют об отсутствии у компонентов реакции гемотоксичности (способности спонтанно лизировать эритроциты).

В приведенном в табл. 21 примере титр комплемента в разведении 1:10 равен 0,15 мл. В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплимента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это – рабочая доза. В приведенном примере она равна 0,2 комплемента в разведении 1:10. Так как все компоненты, участвующие в РСК, должна быть взята в равных объемах (в нашем примере он равен 0:5 мл), необходимо к рабочей дозе комплемента (0,2 мл1:10) добавить 0,3 мл изотонического раствора. Для всего опыта объем каждого из них (комплемента и изотонического раствора.

Для всего опыта объем каждого из них (комплемента и изотонического раствора) умножают на число пробирок, участвующих в РСК. Например, для проведения опыта в 50 пробирках нужно взять 10 мл комплемента 1:10 (0,2 млх50) и 15 мл изотонического раствора (0,3 млх50).

4. Антиген обычно получают готовым с указанием его титра, т.е. того количества, которое после разведения антигена должно содержаться в 1 мл. например, при титре 0,4 его разводят в 0,96 мл изотонического раствора. В опыт беру количество антигена, равное половине титра (0,5 мл). Это его рабочая доза. Говорят общее разведение антигена для всего опыта, умножая 0,5 мл на число пробирок в опыте.

5. Антитело – сыворотка больного. Свежую сыворотку перед опытом инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56˚С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ предпочтительнее: он исключает возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыво­ротки не пригодны для опыта. Сыворотку больного обычно применяют в разведении от 1:10 до 1:160.

Таблица №14

Ингредиенты, мл	пробирки
опыт	контроль
										Гемолитической системы	эритроцитов
Изотонический раствор	1,45	1,4	1,35	1,3	1,25	1,2	1,15	1,1	1,05	1,0	1,5	1,5
Комплемент 1:10	0,05	0,1	0,15	0,2	0,25	0,3	0,35	0,4	0,45	0,5	―	0,5
Гемолитическая система	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	―
3% взвесь эритроцитов барана	―	―	―	―	―	―	―	―	―	―	―	0,5
Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37˚С 1 ч
результат	Нет гемолиза	Гемолиз	Нет гемолиза

Иммунные сыворотки чаще всего готовят в производ­ственных условиях и выпускают инактивированными. Их разводят 1:50 и выше.

Все компоненты готовят с небольшим избытком.

Ингредиенты, мл	Пробирки
Опыт контроль
	сыворотки	антигена	Гемолитической системы	Комплемент в рабочей дозе
½
Фаза 1 Изотонический раствор	―	0,5	0,5	1,5	1,25	1,0	0,5
Испытуемая сыворотка в разведении 1:10	0,5	0,5	―	―	―	―	―
Антиген а рабочей дозе	0,5		0,5	―	―	―	―
Комплемент 1:10 в рабочей дозе	0,5	0,5	0,5	―	0,25	0,5	1,0
Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37˚С 45 мин 1ч или 4˚С 18 ч
Фаза 2 гемолитическая система	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37˚С до полного гемолиза во 2, 3, 6 и 7 пробирках
Результат	Положит. или отрицательный	―	―	++++	(+)	―	―

Таблица №15

Проведение основного опыта

При постановке опыта крайне; важна последова­тельность добавления компонентов. Опыт проводят в две фазы.

Фаза I. В пробирки наливают требуемое количество изотонического раствора натрия хлорида, затем - требуемый объем разведенной сыворотки и в таком же объеме рабочие дозы антигена и комплемента. Опыт обязательно сопровождают контролем всех участвующих в нем ингредиентов: сыворотки, антигена, гемолитической системы и комплемента.

Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37°С 45 мин- 1 ч или при 4 °С («РСК на холоде») 18 ч. За это время при наличии специфического комплекса проис­ходит связывание комплемента. Проведение реакции «на холоде» значительно повышает ее чувствительность и специфичность.

Фаза II. По окончании инкубации во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы, которую предварительно выдерживают в термостате 30 мин (сенси­билизируют). Пробирки встряхивают и снова ставят в термостат.

Учет результат о в. Пробирки оставляют в термо­стате до полного гемолиза в 2, 3, 6 и 7-й пробирках (контроль сыворотки, антигена и комплемента на одну и две дозы). Раньше всего гемолиз наступит в 7-й пробирке, в которой находится двойное количество комплемента. После того как в этой пробирке произойдет гемолиз и содержимое ее станет совершенно прозрачным, нужно особенно внимательно следить за остальными контролями. Как только жидкость в 2, 3 и 6-й пробирках станет прозрачной, -следует немедленно вынуть штатив с пробир­ками из термостата. О том, что опыт не задержали в термостате дольше, чем нужно, говорит наличие легкой мути (неполного гемолиза) в 5-й пробирке - в ней находит­ся только половина рабочей дозы комплемента и полного гемолиза при правильной постановке опыта быть не может.

Гемолиз в контроле сыворотки и антигена (пробирки 2 и 3) указывает на то, что дозы их были выбраны правильно и что сами по себе ни сыворотка, ни антиген комплемент не связывают.

В контроле гемолитической системы (пробирка 4) при ее правильной работе не должно быть даже следов гемолиза - в ней отсутствует комплемент.

Убедившись в том, что контроли прошли правильно, можно учитывать опыт. Отсутствие гемолиза в пробирках опыта расценивают как положительный результат реак­ции. Он свидетельствует о том, что в сыворотке есть антитела, специфичные в отношении взятого антигена. Образованный ими комплекс связал комплемент и воспре­пятствовал его участию в реакции гемолиза. Если в опытных пробирках наступит гемолиз, результат реакции оценивают как отрицательный. В данном случае нет соответствия между антигеном и антителом, комплемент не связан и участвует в реакции гемолиза.

Параллельно с сывороткой больного ставят такой же опыт с заведомо положительной сывороткой (т. е. с сывороткой, в которой есть антитела к данному антигену) и заведомо отрицательной, в которой нет специфических антител. При правильной постановке опыта в первом случае должна быть задержка гемолиза, а во втором случае, будет гемолиз.

Интенсивность реакции выражают следующим образом:

Полная задержка гемолиза. Эритроциты обра­зуют равномерную муть или оседают на дно. В этом случае жидкость в пробирке становится бесцветной;

Лизировано примерно 25% эритроцитов. Осадок меньше, жидкость над ним слегка розовая. Результат РСК также оценивают как резко положительный;

Лизировано примерно 50% эритроцитов. Осадок небольшой, жидкость розовая. Положительный результат РСК;

Лизировано примерно 75% эритроцитов. Незначи­тельный осадок, над ним интенсивно окрашенная жид­кость. Сомнительный результат РСК;

Лизированы все эритроциты. Жидкость интенсивно окрашена и совершенно прозрачна. Отрицательный ре­зультат РСК.

Реакция связывания комплемента (РСК) ставится в две фазы: в первой фазе антиген соединяют с исследуемой сывороткой, в которой предполагают наличие антител и добавляют комплемент, инкубируют в термостате 30 минут.

Вторая фаза: добавляют гемолитическую систему (эритроциты барана +гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате в течение 30 минут учитывают результат.

При положительной РСК антитела сыворотки, соединившись с антигеном, образуют иммунный комплекс, который присоединяет к себе комплемент, и гемолиза не произойдет. Если реакция отрицательная (антител в исследуемой сыворотки нет) - комплемент останется свободным и произойдет гемолиз.

РСК применяется для серологической диагностики сифилиса, гонорее, сыпного тифа и других заболеваний.

Реакции иммунитета с использованием меченых антигенов и антител основаны на том, что один из ингредиентов, участвующих в реакции (антигены или антитела) соединяют с какой-либо меткой, которую легко можно обнаружить. В качестве метки используют флюорохромы (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электроноплотные соединения (ИЭМ).

Иммуноферментный анализ (ИФА), как и другие реакции иммунитета, используется: 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединён с ферментом (например, пероксидазой). Присутствие фермента определяют с помощью субстрата, который при действии фермента окрашивается. Наиболее широко применяется твёрдофазный ИФА.

1) Обнаружение антигена. Первый этап - адсорбция специфических антител на твёрдой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей. Второй этап - добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого лунки промывают. Третий этап - добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, если в исследуемом материале имеются антигены, на поверхности твёрдой фазы образуется комплекс антитела - антиген - антитела, меченые ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилендиамин в смеси с Н 2 О 2 в буферном растворе. Под действием фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску.

2) Обнаружение антител. Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунок. Обычно в коммерческих тест-системах антигены уже адсорбированы на поверхности лунок. Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитело. Третий этап - после отмывания в лунки добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против человеческих глобулинов), меченые ферментом. Результаты реакции оценивают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные, которые имеются в коммерческих системах.

ИФА применяется для диагностики многих инфекционных заболеваниях, в частности, ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов.

Иммуноблоттинг - это разновидность ИФА (сочетание электрофореза и ИФА). Методом электрофореза в геле разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека. Затем переносят разделённые молекулы на поверхность нитроцеллюлозы в том же порядке, в каком они находились в геле. Процесс переноса называется блоттинг, а полученный отпечаток - блот (англ. blot - пятно). На этот отпечаток действуют исследуемой сывороткой. Затем добавляют сыворотку против глобулинов человека, меченую пероксидазой, затем субстрат, который под действием фермента приобретает коричневый цвет. Образуются коричневые полосы в тех местах, где антитела соединились с антигенами. Метод позволяет обнаружить антитела к отдельным антигенам вируса.

Радиоиммунный анализ (РИА). Метод позволяет определить количество антигена в исследуемой пробе. Сначала к иммунной сыворотке присоединяют материал, предположительно содержащий антиген, затем - известный антиген, меченный радиоизотопом, например I 125 . В результате происходит связывание определяемого (немеченого) и известного меченого антигена с ограниченным количеством антител. Так как меченый антиген добавляется в определённой дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая осталась свободной из-за конкуренции с немеченым антигеном и была удалена. Количество меченого антигена, связавшегося с антителами, определяют с помощью счётчика. Оно обратно пропорционально количеству определяемого антигена.

Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). К антигену, например, к вирусу гриппа, присоединяется специфическая антисыворотка, меченая электроноплотным веществом. В качестве метки применяют металлосодержащие белки (ферритин, гемоцианин) или коллоидное золото. При микроскопии в электронном микроскопе делают фотографии, на которых видны вирионы гриппа с присоединившимися к ним тёмными точками - молекулами меченых антител.

Контрольные вопросы

Приобретённый иммунитет, отличие его от наследственного (видового, врождённого). Виды приобретённого иммунитета.

Задача. В семье заболел дифтерией ребенок Валерий, трёх лет. Другие члены семьи не заболели, причём мать переболела дифтерией в детстве, а отец был привит дифтерийным анатоксином. Старшая сестра Наташа, пяти лет, в своё время не была привита дифтерийным анатоксином из-за медицинских противопоказаний, поэтому пришлось провести ей экстренную профилактику с помощью противодифтерийной антитоксической сыворотки. Младший брат, Виталий, трёх месяцев, не заболел, хотя ничем не был привит. В доме есть кошка и собака, они не заболели. Назовите для каждого из членов семьи и для животных вид иммунитета, благодаря которому они не заболели.

Что такое антиген? Какие вещества могут быть антигенами? Полноценные антигены и гаптены, чем они отличаются друг от друга? Структура антигена. Как называется часть молекулы антигена, определяющая его специфичность? Назовите известные Вам антигены. Что такое аутоантигены? Антигенное строение микробной клетки. Жгутиковые и соматические антигены; локализация, буквенное обозначение, химическая природа, отношение к температуре, способ получения, практическое применение. Анатоксин, его свойства, применение, получение. Какая ткань составляет иммунную систему организма? Укажите центральные и периферические органы иммунной системы человека. Опишите процесс формирования гуморального и клеточного иммунного ответа. Укажите клетки, которые осуществляют захват и переваривание антигена; клетки, которые взаимодействуют при формировании гуморального иммунитета, клеточного иммунитета; клетки, которые трансформируются и превращаются в плазмоциты, продуцирующие антитела; клетки, стимулирующие этот процесс; клетки, которые угнетают иммунный ответ; клетки, которые убивают опухолевые клетки, и заражённые вирусом клетки. Что такое антитела? Как получить иммунную сыворотку? Как получить сыворотку, которая бы нейтрализовала столбнячный токсин? Против каких антигенов образуются антитоксины, агглютинины, гемолизины? Какие антитела образуются при введении в организм дифтерийного анатоксина? дифтерийных бактерий? Химическая природа и структура антител. Что такое активный центр иммуноглобулина? Перечислите классы иммуноглобулинов, их свойства. Укажите класс иммуноглобулинов, способных проникать через плаценту. К какому классу относятся секреторные иммуноглобулины? Динамика накопления антител. Чем отличается вторичный иммунный ответ от первичного? Как в практической медицине используются знания о динамике иммунного ответа? Что такое реакции иммунитета, каков их механизм, фазы реакции. В каких 2-х направлениях используют реакции иммунитета? Перечислите реакции иммунитета.

Задача. Поставьте вместо пропущенных слов «анатоксин» или «антитоксин»: _________ является антигеном, _________ является антителом, __________ создаёт при введении в организм активный иммунитет, __________ создаёт при введении в организм пассивный иммунитет, __________ получают путём иммунизации животных, ___________ получают из токсина при воздействии формалином и теплом, ___________ нейтрализует токсины, __________ вызывает в организме образование антител.

Реакция агглютинации: что такое агглютинация, что является антигеном, что - антителом; методы постановки, какие контроли ставятся и для чего; как должны выглядеть контроли. Агглютинирующие сыворотки, что они содержат, как их получают, для чего применяются; что такое титр агглютинирующей сыворотки? Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации: что служит антигеном в этой реакции, как его получают, механизм реакции. Что такое эритроцитарный диагностикум? Что такое антительный эритроцитарный диагностикум? Реакции преципитации: что такое преципитация, что служит антигеном; как получить преципитирующую сыворотку? Что такое титр преципитирующей сыворотки? Методы постановки, практическое применение.

Реакция связывания комплемента (РСК): принцип РСК; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает - положительный или отрицательный результат? Методика постановки РСК. Почему исследуемую сыворотку надо инактивировать? Гемолитическая сыворотка: что содержит, как ее получают, что такое титр и как его определяют? Комплемент: химическая природа, отношение к высокой температуре, где содержится? Как можно разрушить комплемент? Что практически применяется в качестве комплемента?

Задача. На одежде человека, обвиняемого в убийстве, обнаружено пятно крови. С помощью какой реакции можно определить, человеческая ли это кровь; что в этой реакции будет антигеном, и что антителами; какой диагностический препарат нужно иметь в лаборатории для этой реакции, как его приготовляют?

Задача. Как при помощи реакции преципитации определить, является ли доставленный для анализа образец мяса крупного рогатого скота или мясом лошади; какие необходимы диагностические препараты?

Реакция преципитации в агаровом геле, способы постановки, практическое применение.

РСК широко используют для лабораторной диагностики венерических болезней, риккетсиозов, вирусных инфекций. Реакция протекает в две фазы. Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента. Вторая - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген-антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает. При наличии в исследуемой сыворотке антител , комплементарных антигену, образующийся комплекс антиген-антитело связывает (адсорбирует) на себе комплемент. При добавлении гемолитической системы гемолиза не происходит (задержка гемолиза ) , т.к. весь комплемент израсходован на специфическую связь комплекса антиген-антитело, а эритроциты остались неизменными. При отсутствии в сыворотке антител , комплементарных антигену, специфический комплекс антиген-антитело не образуется и комплемент остается не связанным. Поэтому при добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней. Результатом реакции в данном случае будет гемолиз эритроцитов - в пробирках образуется так называемая «лаковая» кровь.

Рис. 6. Схема РСК: а - индикаторная система (эритроциты барана и антитела к ним) в присутствии комплемента определяется в виде гемолиза; б - с сывороткой больного диагностикум (Аг) образует иммунные комплексы и активирует комплемент, результат - задержка гемолиза; в - в сыворотке здорового человека антител нет, комплемент активируется индикаторной системой, результат - гемолиз.

Реакции с применением меченных ат и аг

Реакции с использованием меченных антител и антигенов составляют основу методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное содержание Аг и Ат в исследуемых образцах. В качестве меток могут быть использованы различные ферменты, красители флюорохромы и изотопы.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) Данный метод является экспрессным и высокочувствительным. Существуют две его разновидности. При прямом методе к исследуемой взвеси микробов, фиксированной на стекле, добавляют сыворотку, меченную флуорохромом. Образующийся комплекс антиген-антитело при освещении ультрафиолетовыми (сине-фиолетовыми) лучами дает ярко-зеленое свечение . При непрямом РИФ используют обычные диагностические сыворотки против какого-либо вида микробов. Добавление этой сыворотки к испытуемой взвеси микробов вызывает образование комплекса антиген-антитело. Этот комплекс выявляется с помощью универсальной флюоресцирующей сыворотки, содержащей антитела к гаммаглобулиновой фракции крови того вида животного, от которого была получена диагностическая сыворотка. Светящийся комплекс выявляют при люминесцентной микроскопии.

Рис. 7. Реакция иммунофлюоресценции (схема).

Иммуноферментный анализ (ИФА) В основе иммуноферментного анализа лежит известная иммунная реакция антигена и антитела. Один из этих реагентов является определяемым веществом, а другой - узнающим, обладающим известной стандартной специфичностью (избирательностью) по отношению к определяемому веществу. Для выявления образовавшихся иммунных комплексов (антиген-антитело) используется фермент , которым предварительно метится узнающий компонент (антиген или антитело). Сам фермент, естественно, не виден, поэтому визуализация присутствия вещества, определяемого методом ИФА, достигается применением посредника - хромогена . Это особое химическое соединение, которое хорошо растворимо в воде, и раствор которого бесцветен. Превращение бесцветного хромогена в цветное вещество хромофор происходит под действием фермента, для которого хромоген является субстратом.

Рис. 8. Иммуноферментный анализ (схема).

Аутоантигены - вещества, обладающие способностью вызывать иммунные реакции в организме, из которого они получены. Их содержат мозг, хрусталик глаза, сперматозоиды, паращитовидные железы, гомогенаты семенной железы, кожи, почек, печени и других тканей. Так как в обычных условиях аутоантигены не приходят в соприкосновение с иммунными системами организма, антитела к подобным клеткам и тканям не образуются. Однако при повреждении этих тканей аутоантигены могут всасываться и вызывать образование антител, оказывающих повреждающее действие на соот­ветствующие клетки. Аутоантигены могут возникать также из клеток некоторых органов и тканей под влиянием охлаждения, медикаментозного воздействия, вирусных инфекций, бактериальных бел­ков и токсинов, например стрептококков, стафилококков, микобактерии туберкулеза, и других факто­ров. Они образуются в этом случае вследствие нарушения видовой специфичности собственных антигенов организма.

Антитела, будучи сложными гликопротеидными молекулами, сами по себе также являются антигенами. В их составе различают три типа антигенных детерминантов (элитипов): изотипы, аллотипы и идиотипы.

Изотипы - детерминанты, по которым различаются классы и подклассы тяжелых цепей и вариан­ты каппа- и лямбда- легких цепей.

Аллотипы - детерминанты, кодируемые аллелями данного иммуноглобулинового гена.

Идиотипы - антигенные детерминанты, образуемые активными центрами молекул антител.

На долю класса IgG приходится около 75% общего количества всех иммуноглобулинов сыворотки крови человека.

Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания комплемента (РДСК)

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК) И РЕАКЦИЯ ДЛИТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РДСК)

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА, РСК, реакция Борде - Жангу [по имени бактериологов Ж. Борде (J. Bordet) и О. Жангу (О. Gengou), 1901], высокоспецифичная и очень чувствительная серологич. реакция, основанная на свойстве комплекса антиген - антитело фиксировать свободный комплемент.

Комплемент (система комплемента) (от лат.complementum - дополнение), группа глобулярных белков сыворотки крови животных и человека, представляющих собой часть иммунной системы организма. При попадании в организм инфицирующих его бактерий или вирусов, некоторых токсинов или возникновении собственных трансформированных клеток происходит активация комплемента, в результате чего клетки-мишени лизируются (разрушаются), а токсины и вирусы нейтрализуются. Поэтому систему комплементов рассматривают наряду с макрофагами как передовой рубеж иммунной защиты организма.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов и в серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген - антитело. По существу, это две серологические реакции.

Первая система - основная состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

связывание комплемент реакция серодиагностика

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый иммунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой (при соответствии в ней антигена и антитела), то во второй системе гемолиза не будет - так как нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее Осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то иммунный комплекс не образуется и комплемент останется свободным. Оставшийся свободным, комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, - результат РСК отрицательный (содержимое пробирок прозрачно - "лаковая кровь").

Компоненты реакции связывания комплемента:

1. Антиген - обычно лизат, экстракт, гаптен; реже взвесь микроорганизмов

2. Антитело - сыворотка больного

3. Комплемент - сыворотка морских свинок

4. Антиген - эритроциты барана Гемолитическая система

5. Антитело - гемолизин к эритроцитам барана

6. Изотонический раствор

Подготовка ингредиентов

1. Сыворотку разводят в 3 раза меньше ее титра. Готовят общее разведение сыворотки для всего опыта, объем которого определяют, умножив объем сыворотки в одной пробирке (например, 0,5 мл) на число пробирок, немного превышающее число их в опыте. Избыток жидкости необходим при приготовлении всех компонентов реакции: часть ее остается на стенках пробирок, колб, пипеток. Объемы разведенного гемолизина и взвеси эритроцитов, приливая сыворотку к эритроцитам, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37°С (сенсибилизируют).

2. Эритроциты барана. Готовят 3% взвесь отмытых эритроцитов барана на все количество пробирок в опыте. Для приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт смешивают равные объемы эритроцитов барана с антителом к ним.

3. Комплемент обычно разводят 1: 10. Перед каждым опытом его обязательно титруют. Титр комплемента - это его наименьшее количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1 ч при 37°С.

4. Антиген обычно получают готовым с указанием его титра, т.е. того количества, которое после разведения антигена должно содержаться в 1 мл. Например, при титре 0,4 его разводят в 0,96 мл изотонического раствора. В опыт берут количество антигена, равное половине титра (0,5 мл). Это его рабочая доза. Готовят общее разведение антигена для всего опыта, умножая 0,5 мл на число пробирок в опыте.

5. Антитело - сыворотка больного. Свежую сыворотку перед опытом инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56°С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ предпочтительнее: он исключает возможность перегрева

Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента).

Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1: 5 и 1: 10 (доза сыворотки 0,04 куб. см и 0,02 куб. см со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном (на специфичность) и без антигена (на антикомплементарность).

Испытуемые и контрольные сыворотки инактивируют в день постановки реакции в разведенном виде при 56-65°С (в зависимости от вида животных) в течение 30 мин. (также в РДСК).

Оба этапа реакции проводят в водяной бане при 37-38°С, бактериолитическую систему выдерживают 60 мин, второй этап реакции (с гемолитической системой) - 20 мин.

Контроли главного опыта РСК:

позитивная сыворотка в разведении 1: 5 без антигена и с контрольным антигеном; в разведениях от 1: 5 до ее титра со специфическим антигеном;

негативная сыворотка в разведениях 1: 5 и 1: 10 со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном и без антигена - антигены специфический и контрольный в двойной дозе - на антикомплементарность (комплемент +) и на гемотоксичность (комплемент);

гемолитическая система на гемотоксичность (комплемент).

Учет результатов. В контролях не должно быть даже следов гемолиза, так как в одном из них нет комплемента, в другом - гемолизина. Контроли свидетельствуют об отсутствии у компонентов реакции гемотоксичности (способности спонтанно лизировать эритроциты).

В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это - рабочая доза.

Существуют различные варианты постановки РСК: классич. метод постановки в виде макро - и микровариантов, реакция длительного связывания комплемента (РДСК) на холоде, метод количеств. РСК по 50 % -ному гемолизу сенсибилизированных эритроцитов и др. Для диагностики ряда заболеваний применяют более чувствительный метод - РДСК.

Постановка реакции длительного связывания комплемента (РДСК).

Первую фазу реакции проводят в холодильнике при 2-6°С в течение 16-18 час., вторую фазу в водяной бане 20 мин при 37-38°С.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1: 25 или 1: 30 (при определении его рабочего разведения).

В первый день разливают сыворотки и антиген для главного опыта. Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента). Контроли РДСК такие же как при постановке РСК.

Затем во все пробирки главного опыта и соответствующих контролей разливают комплемент по 0,2 куб. см в зависимости от его рабочего разведения, пробирки встряхивают и помещают в холодильник на 16-18 час. при 2-6°С.

На следующий день штативы с первой фазой вынимают из холодильника и после выдерживания в течение 20-30 мин. при комнатной температуре во все пробирки разливают гемолитическую систему в дозе (в приведенном примере - 0,6 куб. см). Штативы встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин. при 37-38°С.

Схема главного опыта РДСК представлена в таблице 3.

Учет результатов РСК, РДСК проводят дважды: первый раз - сразу после водяной бани, второй - после оседания эритроцитов на дно пробирки (через 3-4 часа после водяной бани) или на следующий день при хранении в холодильнике от 2° до 6°С.

Для объективного определения результатов реакции оценку рекомендуется проводить в процентах гемолиза. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным (100%) гемолизом и жидкость из них сливают в одну пробирку. Из нее готовят разведения с меньшим процентом гемолиза так называемую "Стандартную " шкалу.

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со степенью гемолиза в "стандартных" пробирках и процент гемолиза выражают в крестах.

Степень задержки обратно пропорциональна проценту гемолиза эритроцитов:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная, бесцветная;

+++ (3 креста) - гемолиз 25 % эритроцитов;

++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;

+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;

(минус) - полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Оценка результатов РСК, РДСК.

Оценивают испытуемые сыворотки в разведениях 1: 5 и 1: 10 (0,04 куб. см, 0,02 куб. см) при полном гемолизе эритроцитов в контроле сыворотки без антигена и с контрольным антигеном.

Положительной оценивают реакцию при задержке гемолиза эритроцитов на 3-4 креста в разведении 1: 10.

Сомнительной - при задержке гемолиза эритроцитов на 1 крест в разведении сыворотки 1: 10 и от 2 до 4 крестов в разведении 1: 5.

Отрицательной - при полном гемолизе эритроцитов в разведениях сыворотки 1: 5и 1: 10.

Оглавление темы "Реакции преципитации (РП). Иммуноэлектрофорез. Сложные реакции иммунодиагностики.":

Сложные реакции иммунодиагностики. Реакция связывания комплемента (РСК). Феномен лаковой крови. Этапы, техника реакции связывания комплемента.

(РСК ) предложена Ж. Борде и О. Жангу . Реакция включает две фазы (рис. 10-18).

Рис. 10-18. Реакция связывания комплемента . А - отрицательная реакция. Специфические в отношении исследуемого Аг AT отсутствуют. Образования иммунных комплексов, связывающих комплемент, не происходит. Молекулы комплемента сорбируются на клетках-мишенях (эритроцитах), вызывая их лизис. Б - положительная реакция. Имеющиеся в сыворотке AT специфически связывают исследуемый Аг, образуя иммунный комплекс. Последний связывает комплемент, и лизиса эритроцитов не наблюдают.

В фазе I (специфической) реакции связывания комплемента (РСК) искомый Аг (или AT) реагирует с диагностической антисывороткой (или Аг-диагностикумом) и комплементом. Образующийся комплекс Аг-АТ связывает комплемент.

В фазе II (индикаторной) реакции связывания комплемента (РСК) определяют наличие свободного комплемента внесением в реакционную среду гемолитической системы - эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей AT к ним. Если Аг и AT не соответствуют друг другу и не образуют иммунных комплексов, то связывания комплемента не происходит. В этом. случае свободный комплемент взаимодействует с компонентами гемолитической системы, фиксируясь на комплексе эритроцит-антиэритроцита рное AT. Следствие этого - гемолиз индикаторных клеток (феномен «лаковой крови») - реакцию считают отрицательной.

Если в фазе I реакции связывания комплемента (РСК) AT и Аг соответствуют друг другу, то образующиеся иммунные комплексы связывают комплемент, разрушения эритроцитов после внесения гемолитической системы не наблюдают и реакцию считают положительной. Основные недостатки РСК: сложность (включает 5 компонентов), лабильность некоторых компонентов [их необходимо готовить прямо перед постановкой реакции (комплемент) либо за несколько суток (эритроциты барана)] и возможные антикомплементарные свойства у сывороток и Аг. Тем не менее РСК применяют в диагностике многих заболеваний, например при диагностике сифилиса (реакция Вассерманна).