Проба кумбса что показывает при анемии. Аутоимунные гемолитические анемии

Антитела , находящиеся на поверхности эритроцитов, могут быть как в статичном, так и в свободном состоянии вплазме крови . В зависимости от состояния антител проводится прямая или непрямая реакция Кумбса. Если есть основания для предположения, что антитела зафиксированы на поверхности эритроцитов, проводится прямой тест Кумбса. В этом случае тест проходит в один этап - добавляетсяантиглобулиновая сыворотка . Если на поверхности эритроцитов присутствуют неполные антитела, происходитагглютинация эритроцитов.

Непрямая реакция

Непрямая реакция Кумбса протекает в 2 этапа. Сначала необходимо искусственно осуществить сенсибилизацию эритроцитов. Для этого эритроциты и исследуемую сыворотку крови инкубируют, что вызывает фиксацию антител на поверхности эритроцитов. После чего проводится второй этап теста Кумбса - добавление антиглобулиновой сыворотки.

Реакция преципитации - РП (от лат praecipilo осаждать) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом . Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиапьная иммунодиффузия, иммуноэпектрофорез и др.

HLA типирование - исследование главного комплекса гистосовместимости человека - HLA комплекса. Это образование включает в себя область генов на 6-й хромосоме, которые кодируют HLA-антигены, участвующие в различных реакциях иммунного ответа.

Задачи при HLA типировании могут стоять самые разные - биологическая идентификация (HLA-тип наследуется вместе с родительскими генами), определение предрасположенности к различным заболеваниям, подбор доноров для пересадки органов - при этом производится сравнение результатов HLA типирования тканей донора и реципиента. С помощью HLA типирования определяют, и насколько супруги сходны или различимы по антигенам тканевой совместимости, чтобы диагностировать случаи бесплодия.

HLA типирование предполагает анализ полиморфизма HLA и проводится двумя методами - серологическим и молекулярно-генетическим. Классический серологический метод HLA типирования основан на микролимфоцитотоксическом тесте, а молекулярный метод использует проведение ПЦР (полимеразную цепную реакцию).

Серологическое HLA типирование проводится на выделенных клеточных популяциях. Антигены главного комплекса гистосовместимости несут на себе в основном лимфоциты. Поэтому суспензию Т лимфоцитов используют в качестве основных носителей антигенов I класса, и суспензию В лимфоцитов для определения антигенов HLA II класса. Для выделения необходимых клеточных популяций из цельной крови используют либо центрифугирование, либо иммуномагнитную сепарацию. Считается, что первый способ может привести к ложноположительным данным, так как при этом происходит гибель части клеток. Второй способ признан более специфичным - при этом более 95% клеток остаются жизнеспособными.

Но основой постановки лимфоцитотоксического теста HLA типирования является специфическая сыворотка, содержащая антитела к различным аллельным вариантам антигенов HLA I и II классов. Серологический тест позволяет определить HLA-тип путем изучения того, какие из сывороток реагируют с лимфоцитами, а какие - нет.

Если между клетками и сывороткой происходит реакция, в результате на поверхности клетки образуется комплекс антиген-антитело. После добавления раствора, содержащего комплемент, происходит лизис и гибель клетки. Оценивают серологический тест HLA типирования с помощью флуоресцентной микроскопии по оценке позитивной (красная флуоресценция) и негативной (зеленая флуоресценция) реакций, или фазово-контрастной микроскопии по окраске ядер погибших клеток. Результат HLA типирования выводят с учетом специфичности прореагировавших сывороток и перекрестно реагирующих групп антигенов, интенсивности реакции цитотоксичности.

Недостатками серологического HLA типирования являются наличие перекрестных реакций, слабое сродство антител или низкая экспрессия HLA-антигенов, отсутствие белковых продуктов у ряда HLA-генов.

Более современные, молекулярные методы HLA типирования используют уже стандартизованные синтетические образцы, которые реагируют не с антигенами на поверхности лейкоцитов, а с ДНК и прямо указывают на то, какие антигены присутствуют в пробе. Молекулярные методы не требуют живых лейкоцитов, любая человеческая клетка может быть подвержена изучению, и для работы достаточно несколько микролитров крови или можно ограничиться соскобом со слизистой оболочки рта.

Молекулярно-генетическое HLA типирование использует метод ПЦР, первым этапом которой является получение чистой геномной ДНК (из цельной крови, лейкоцитарной суспензии, тканей).

Затем образец ДНК копируется - амплифицируется в пробирке с использованием праймеров (коротких одноцепочечных ДНК), специфичных к определенному HLA -локусу. Концы каждого из пары праймеров должны быть строго комплементарны уникальной последовательности, соответствующей конкретному аллелю, в противном случае амплификация не осуществляется.

После ПЦР, в ходе многократного копирования, получается большое количество фрагментов ДНК, которое можно оценить визуально. Для этого реакционные смеси подвергают электролизу или гибридизации, и определяют, произошла ли специфическая амплификация, при помощи программы или таблицы. Результат HLA типирования представляется в форме всестороннего отчета на генном и аллельном уровнях. Из-за стандартизованности используемых образцов, молекулярное HLA типирование точнее серологического. Кроме того, оно дает больше информации (больше новых аллелей ДНК) и более высокий уровень ее детализации, поскольку позволяет идентифицировать не только антигены, но и сами аллели, обуславливающие, какой именно антиген присутствует на клетке.

Реакция иммунного лизиса. В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису клеток. Из реакций иммунного лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и редко - реакция бактериолиза (главным образом при дифференциации Холерных и холероподобных вибрионов).

Реакция гемолиза. Под влиянием реакции с антителами в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость - «лаковую кровь» вследствие выхода гемоглобина. При постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия (связывания) свободного комплемента.

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) является одним из вариантов реакции гемолиза. Она позволяет определить число антителообразующих клеток. Количество клеток, секретирую-щих антитела - гемолизины, определяют по числу бляшек гемолиза, возникающих в агаровом геле, содержащем эритроциты, суспензию клеток исследуемой лимфоидной ткани и комплемент.

Иммунофлюоресцентный метод

(РИФ, реакция иммунофлюоресценции) - метод выявления специфических Аг (Ат) с помощью Ат (Аг), конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Применяется для экспресс-д-ки инфекц. заболеваний (идентификация возбудителя в иссл. материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток. Прямой И. м. состоит в обработке среза ткани или мазка из патологического материала или микробной к-ры с-кой, содержащей специфические Ат, конъюгированные с флюорохромом; препарат промывают для освобождения от несвязанных Ат и рассматривают в люминесцентный микроскоп. В положительных случаях по периферии объекта появляется светящийся иммунный комплекс. Необходим контроль для исключения неспецифического свечения. Принепрямом. И. м. на первом этапе срез ткани или мазок обрабатывают нефлюоресцирующей специфической с-кой, на втором -люминесцирующей с-кой против-глобулинов того животного, с-ка к-рого была применена на первом этапе. В положительном случае образуется светящийся комплекс, состоящий из Аг, Ат к нему и Ат против Ат (сэндвич-метод). Кроме люминесцентного микроскопа для учета РИФ при фенотипировании клеток применяютлазерный сортировщик клеток .

Проточная цитометрия - метод оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.

Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).

рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток).

интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20)- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.

Coombs test

Прямая проба Кумбса — антиглобулиновый тест (агглютинация в геле, позволяет выявить полные двухвалентные антитела), с помощью которого определяют антитела класса IgG и С3-компонент комплемента на поверхности эритроцитов. Обычно антитела, выявляемые прямой пробой Кумбса, имеют широкую специфичность, не ассоциированную с хорошо установленным антигеном. Положительная прямая проба Кумбса чётко указывает на наличие у больного гемолитической анемии, хотя не все больные с положительным прямым антиглобулиновым тестом страдают этим заболеванием. Приблизительно у 10% больных антитела или компоненты комплемента на мембране эритроцитов не удаётся определить прямой пробой Кумбса (тест отрицательный), но, тем не менее, они страдают аутоиммунной гемолитической анемией. Для уточнения специфичности антител в таких случаях используют тесты с их элюцией. Прямая проба Кумбса, положительная только к комплементу, обычно имеет отношение к холодовым антителам типа IgM. В этом случае антитела IgM не присутствуют на эритроцитах при базальной температуре тела. Однако вследствие того, что антитела IgM активно фиксируют комплемент, и комплемент остаётся на эритроцитах, при данной форме аутоиммунной гемолитической анемии (болезнь холодовых аггютининов) проба Кумбса будет положительна только к комплементу.

Прямая проба Кумбса положительна при аутоиммунной гемолитической анемии, вызываемой тепловыми антителами, аутоиммунной лекарственной анемии (при приёме метилдопа до 20% больных имеют положительную реакцию), лекарственно-адсорбционном типе гемолитической анемии, иммунокомплексном типе гемолитической анемии (проба положительна только по отношению С3), при аутоиммунной гемолитической анемии, вызываемой холодовыми антителами — болезни холодовых агглютининов (проба положительна только по отношению С3). При пароксизмальной холодовой гемоглобинурии прямая проба Кумбса отрицательная.
В остром периоде заболевания, в связи с разрушением эритроцитов, на которых фиксировалось большое количество антител, при гемолитическом кризе, а также при недостаточном количестве антител при хроническом течении болезни может отмечаться отрицательная прямая проба Кумбса.

• Важным условием обеспечения качества лабораторного исследования крови является взятие материала натощак, в утреннее время (до 12:00).
• За 12 часов до исследования следует исключить прием алкоголя, курение, прием пищи, ограничить физическую активность.
• Утром в день взятия крови на исследование можно выпить воду.
• Исключить прием лекарств; если отменить прием лекарств невозможно, необходимо проинформировать об этом лабораторию.
• Взятие материала желательно проводить до проведения любых медицинских диагностических манипуляций.
• При оценке уровня гормонов у женщин важно учитывать день менструального цикла, когда наиболее оптимально определять некоторые гормоны. Эту информацию Вы можете получить у лечащего доктора.

Проба Кумбса является методом лабораторного исследования, сделанного путем воздействия на гемагглютинацию. В ее основании лежит восприимчивость антител к иммуноглобулинам и элементам фермента, а также их способность агглютинировать эритроциты, покрытые C3 либо Lg.

Прямая диагностика Кумбса

Используется для обнаружения антител или составляющих комплемента, установленных с наружной части клеток. Прямая проба Кумбса выполняется следующими действиями.

Применение такой пробы

Прямую диагностику Кумбса используют в определенных случаях, таких, как:

• трансфузионные воздействия;
• аутоиммунный гемолиз;
• медикаментозная гемолитическая анемия.

Непрямая проба Кумбса

Данная диагностика дает возможность выявить антитела к клеткам в сыворотке, которую инкубируют, как правило, с донорскими эритроцитами типа 0, а потом осуществляют прямую пробу. Применяют непрямую диагностику Кумбса в следующих случаях:

Как готовиться к анализу

Существуют некоторые правила подготовки к обследованию.

1. Если пациент является новорожденным, родителям нужно знать, что исследование будет способствовать диагностированию ГЗН (гемолитическому заболеванию новорожденных).
2. В случае если у больного есть подозрения гемолитического малокровия, ему должны объяснить, что анализ позволит узнать, вызвано ли оно защитными расстройствами, приемами лекарств либо другими факторами.
3. Проба Кумбса прямая и непрямая не делает никаких ограничений в режиме питания или диете.
4. Необходимо уведомить пациента, что для обследования потребуется взять кровь из вены, а также сказать ему, когда именно будет производиться венепункция.
5. Еще следует предупредить о вероятности неприятных ощущений в период наложения повязки на руку и самой процедуры.
6. Препараты, которые способны подействовать на результат образца, нужно отменить.

К таким лекарствам относятся:

• «Стрептомицин»;
• «Метилдофа»;
• «Прокаинамид»;
• сульфаниламиды;
• «Мелфалан»;
• «Хинидин»;
• «Рифампин»;
• «Изониазид»;
• цефалоспорины;
• «Гидралазин»;
• «Хлорпромазин»;
• «Леводопа»;
• «Тетрациклин»;
• «Дифенилгидантоин»;
• «Этосуксимид»;
• «Пенициллин»;
• мефенаминовая кислота.

Забор крови совершают с утра натощак.

Как проводится мероприятие

Проба Кумбса осуществляется в таком порядке:

1. При выполнении диагностики у взрослого больного после венепункции берут кровь в трубочки с ЭДТА (этилендиаминтетраацетатом).
2. У новорожденного производят забор крови из пуповины в мензурку с ЭДТА.
3. Зону прокола прижимают ватным тампоном до прекращения кровотечения.
4. При появлении синяка в месте венепункции прописывают согревающие компрессы.
5. После набора крови пациенту разрешается вернуться к приему отменных препаратов.
6. Необходимо сообщить родителям новорожденного, что для наблюдения за динамикой анемии может потребоваться вторичный анализ.

Преимущества пробы Кумбса

Такое исследование имеет некоторые превосходства, а именно:

Минусы анализа

Проба Кумбса положительная является достаточно трудоемким методом осмотра, предполагающим характерную точность выполнения. При ее использовании можно столкнуться с определенными трудностями, связанными в особенности с интерпретацией слабоположительных воздействий.

Установлено, что ошибочные отрицательные либо слабоположительные реакции при производстве проб Кумбса могут стать последствиями неудовлетворительно активной отмывки клеток, ослабления антиглобулинового реагента остатками сыворотки, а также соединения с необезжиренной наружностью, на которой может закрепляться антиглобулин, утрачивая при этом свою действенность.

Проба Кумбса отличается еще одним недостатком - малостойкостью антиглобулинового реагента, приобретение и сохранение которого имеют индивидуальные особенности, что аналогично делает сложной численную оценку воздействия антиглобулиновой сыворотки на гемагглютинацию.

Болезни, которые можно обнаружить при исследовании

Диагностика Кумбса дает возможность обнаружить некоторые виды заболеваний, такие, как:

• гемолитическое недомогание новорожденных;
• различные трансфузионные реакции;
• аутоиммунный гемолиз;
• лекарственное гемолитическое малокровие.

На сегодняшний день проба Кумбса считается довольно популярной системой исследования крови как у взрослого человека, так и у новорожденного. Она дает возможность выявить множество различных болезней.

На поверхности эритроцитов находится большое количество антигенов. В зависимости от вида этих антигенов выделяют группы крови, самые изученные группы - АВО, Rh, Kell, Duffy и мн...

Средняя цена в вашем регионе: 2645 от 2645 … до 2645

1 лабораторий делают данный анализ в вашем регионе

Описание исследования

Подготовка к исследованию: Кровь берут из вены, а затем получают сыворотку (плазма крови без фибриногена) путем естесственного свертывания или путем осаждения фибриногена. Исследуемый материал: Взятие крови

На поверхности эритроцитов находится большое количество антигенов. В зависимости от вида этих антигенов выделяют группы крови, самые изученные группы - АВО, Rh, Kell, Duffy и многи другие системы. В норме в крови существуют антитела к антигенам другой группы, но при переливании крови, беременности, аутоиммунных заболеваниях и др. обнаруживаются антитела к своим антигенам.Неполные антитела к эритроцитам

Метод

Непрямая реакция Кумбса основана на выявлении агглютинации (слипания) эритроцитов, у которых на поверхности имеются неполные антитела, которая появляется при добавлении антиглобулиновой сыворотки.

На первом этапе в одну пробирку вносят донорские эритроциты (O(I) группа, Rh+) и исследуемую сыворотку. Если неполные антитела к эритроцитам присутствуют в исследуемой сыворотке, то они фиксируются на поверхности донорских эритроцитов.

На втором этапе на стекло наносят донорские эритроциты с антителами (если они были) и стандартную антиглобулиновую сыворотку с антителами к человеческим иммуноглобулинам. Если на первом этапе антитела к эритроцитам зафиксировались на поверхности эритроцитов, то при добавлении стандартной сыворотки эритроциты склеиваются из-за взаимодействие антител.

Референсные значения - норма
(Реакция Кумбса непрямая (антиглобулиновый тест, выявление неполных антиэритроцитарных антител), кровь)

Информация, касающаяся референсных значений показателей, а также сам состав входящих в анализ показателей может несколько отличаться в зависимости от лаборатории!

Норма:

В норме антител к собственным эритроцитам не должно быть, при постановке реакции Кумбса агрегации эритроцитов не происходит.

Показания

Исследование гуморального специфического иммунитета при подозрении на аутоиммунные реакции в организме, резус-конфликт между матерью и плодом, определение совместимости крови донора и реципиента

Повышение значений (положительный результат)

Антитела к эритроцитам обнаруживают при:

1. Аутоиммунных гемолитических анемиях

2. Гемолитической болезни новорожденных

3. Системных заболеваниях соединительной ткани

4. Хроническом активном гепатите и др.

Принцип антиглобулинового . Антиэритроцитные антитела неполного типа и молекулы комплемента (С), находящиеся на поверхности эритроцитов выявимы - прямой тест - их агглютинацией в контакте с животной сывороткой, содержащей антитела на человеческий антиглобулин (антиглобулиновая сыворотка). Свободные в сыворотке неполные антитела выявляются - косвенный тест - их закреплением на смеси нормальных эритроцитов группы 0, все антигены которых принадлежат известной резус-системе, далее агглютинируемые под воздействием антиглобулиновой сыворотки.

Материалы, реагенты антиглобулинового теста Кумбса : пробирки на 10/100 мл; градуированные пипетки на 1, 2 мл; пастеровские пипетки; штативы; предметные нешлифованные стекла; 8,5‰ раствор NaCl; эритроциты. Эритроциты больного, равно как и принадлежащие к группе 0 получим из свежеотобранной крови на противосвертывающем веществе (раствор ЭДТА).

Эритроциты группы 0 отобрать с таким расчетом, чтобы они исходили от лиц в норме и содержали все антигены резус-системы . Их можно сохранять до 7 дней в аутологической плазме, при температуре + 4°С. В случае отсутствия эритроцитов группы 0, известной антигенной мозаики, можно использовать смесь эритроцитов группы 0, резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов.

Сыворотка больного должна быть свежеотобранной.

Антиглобулиновая сыворотка производится институтом им. д-ра И. Кантакузино, выпускается в лиофилизированном виде в содержащих 1 мл ампулах. После растворения сыворотку хранить при температуре -20°С.

Техника антиглобулинового теста Кумбса :
а) Прямой тест Кумбса : эритроциты больного промыть 3 раза 8,5‰ раствором NaCl.
На несколько предметных стекол нанести по крупной капле из разведений антиглобулиновой сыворотки, а рядом - по маленькой капле из осадка эритроцитов больного; перемешать капли углом стекла. Приготовленный материал оставить на столе 5 мин., затем исследовать на наличие агглютинатов. В случае положительного результата определить максимальный агглютинирующий титр.

б) Косвенный тест Кумбса : эритроциты группы 0, резусположительные и резус-отрицательные промыть 3 раза 8,5‰ раствором NaCl и подвергнуть воздействию сыворотки больного из расчета 2 капли эритроцитов на 8-10 капель сыворотки, затем, в течение 60 мин., провести инкубацию при температуре 37°С. После этого снова трижды промыть эритроциты и воздействовать на них антиглобулиновой сывороткой, по указаниям для прямого теста Кумбса.

Когда речь идет о холодовых активных антителах сенсибилизацию эритроцитов группы 0 провести 60 мин. при температуре + 4°С.

Примечание : 1) Не проводить прямой тест Кумбса на эритроцитах, сохраненных один или несколько дней при температуре + 4°С или комнатной температуре, поскольку результаты могут оказаться ложноположительными за счет фиксации имеющихся в нормальной сыворотке непол ных, активных на холоде антител. 2) В случаях выраженной гиперпротеинемии промывать эритроциты 4-5 раз и проверить отсутствие сывороточных белков в последней промывной жидкости, с помощью сулфосалициловой кислоты.

Возможный остаток 2 мкг IgG/мл в эритроцитном осадке может нейтрализовать антиглобулиновую сыворотку . Тест Кумбса можно проводить и с помощью моноспецифических анти-IgG, -IgM, -IgA -С3 и -С4 сывороток в целях уточнения вида, находящихся на поверхности эритроцитов глуболин, например, у страдающих аутоиммунной гемолитической анемией.